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β干扰素(Interferon beta,IFN-β)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,主要由成纤维细胞受诱生剂作用而产生。猪β干扰素具有抗病毒作用,对机体免疫系统具有强大的调节作用,因此既可以与疫苗配合使用,增强免疫效果,也可以单独使用,治疗猪病毒性疾病,提高动物的免疫机能。本研究以猪β干扰素为研究对象,对猪β干扰素的进行了原核表达,并对猪β干扰素的密码子进行了优化改造,采用毕赤酵母真核表达系统对改造后的猪β干扰素成功进行了表达和抗病毒活性的研究。主要研究内容如下:
1.猪β干扰素的原核表达根据猪β干扰素的核苷酸序列,设计合成一对引物β1、β2用于合成猪β干扰素的成熟肽基因,利用T/A克隆连接到pMD18-T Sample载体中,再将克隆得到的猪β干扰素基因亚克隆至原核表达载体pET32a(+)的EcoRⅠ和HindⅢ之间,经酶切鉴定和测序鉴定得到阳性克隆。重组质粒pET-PolFNβ转化至BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,结果表明pET-IFNβ在BL21(DE3)中成功表达,所表达的融合蛋白分子为35kD左右,与预期相符,但是表达量很低,这可能与载体pET32a(+)的表达量有关。目的蛋白主要以包涵体形式存在,包涵体经变性溶解、透析复性后测其总蛋白浓度为184mg/L,并测定其在BHK-VSV系统上的活性为1.8×104IU/L,活性较低,这可能与表达产物的表达量及表达产物的复性有关。
2.猪β干扰素的基因改造表达参照猪β干扰素的基因序列以及毕赤酵母菌的密码子用法分析,依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性,在保持原猪β干扰素蛋白序列不变的基础上,选择高表达密码子对猪β干扰素成熟蛋白基因进行重新设计合成。设计合成一对引物P1、P2用于扩增猪β干扰素成熟蛋白基因,以及一对表达载体引物P3、P4。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析,在上游引物P1中加入了限制性内切酶ClαⅠ,在下游引物P2中加入了限制性内切酶XbαⅠ。
将含有人工合成的猪β干扰素成熟蛋白编码基因的重组克隆载体pMD18-T-PolFNβ和酵母表达载体pPICZαC进行ClαⅠ和XbαⅠ双酶切,然后连接转化大肠杆菌,得到重组表达质粒pPICZαC-PolFNβ,经PCR、双酶切鉴定,并送公司测序鉴定,结果显示重新设计合成的目的基因已经正确的插入表达载体pPICZαC中。
重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ经SαcⅠ单酶切后,电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X-33,获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度,筛选出具高抗性的转化子。保持甲醇终浓度为1.0％进行诱导表达。pPICZαC-PoIFNβ诱导表达上清液做SDS-PAGE电泳分析,得到分子量约为25kD和28kD的蛋白条带,比理论值偏大。将表达蛋白进行Western blotting分析,显示表达蛋白可与PolFNβ一抗结合,具有免疫原性。通过紫外光谱吸收法和灰度扫描法测定表达上清液中目的蛋白含量为78.2%,约为127.9mg/L。
本研究所表达的重组猪β干扰素在BHK-VSV系统上的活性为2.8×106IU/L。用同样方法测定了重组猪β干扰素的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性为1.6×106IU/L。该试验结果表明重组猪β干扰素能有效抑制PRRSV在体外的增殖,并有望应用于临床对PRRSV的防制。