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肠道是缺血再灌注损伤(IRI)最敏感的组织之一，而且它是机体最大的细菌和内毒素储藏场所。正常情况下，具有完整生理功能的肠粘膜对肠道中的细菌和内毒素起到屏障的作用，使其不能进入机体内。肠的IRI是外科实践中常见的组织器官损伤之一，它不仅可以引起消化道局部的组织损害，而且可以导致肠内细菌和毒素移位进入血液循环，引起肠源性内毒素血症和细菌移位，进而导致大量相关介质和细胞因子的释放，甚至发生多脏器功能失常综合征(MODS)。肠的IRI在腹主动脉瘤手术、小肠移植、心肺分流术、绞窄疝和新生儿坏死性小肠结肠炎等疾患的演变过程中起重要作用。越来越多的研究证明，IRI的机制是一个相当复杂的过程，其中包括Ca2+超载、白细胞粘附、高能磷酸化合物的缺乏、抗氧自由基的损伤和一氧化氮(NO)的作用等。其中NO在肠IRI中的作用受到广泛的关注。对一氧化氮合酶(NOS)在肠IRI中表达的研究，有助于我们探索控制肠IRI的方法，为研究相关疾病的发病机制和治疗提供实验依据。
NO是一种非经典的神经递质，在肠的IRI中起着非常重要的作用。它是由NOS催化L-精氨酸生成。NOS的三个亚型已被纯化和克隆成功，Ⅰ型为神经元型NOS(nNOSorNOS1)，Ⅱ型为诱导型NOS(iNOSorNOS2)，Ⅲ型为内皮型NOS(eNOSorNOS3)，nNOS和eNOS又常称为结构型NOS(cNOS)。NOS是NO合成过程中的重要限速酶，体内NO的生物作用完全依赖NOS的活性。cNOS是生理状态的酶，为Ca2+依赖性，它的活性在翻译后水平受细胞内Ca2+浓度的调节。iNOS是一种非Ca2+依赖性的酶。在生理状态下，iNOS并不表达，但病理情况下，生成iNOS。nNOS主要分布于小肠壁的神经丛及神经纤维，在肌间神经丛分布较多，粘膜下神经丛中分布相对较少，但在小肠中的nNOS主要为胞浆型。eNOS主要分布于血管内皮细胞及粘膜固有层的组织细胞内。iNOS主要分布在巨噬细胞、肥大细胞、纤维母细胞等免疫细胞和组织细胞中。用消化道全层铺片技术(WMSP)研究证明，在小肠，肌间神经丛和粘膜下神经丛中NOS阳性神经胞体多为卵圆形，胞浆着色较深，胞核不着色。
本实验采用免疫组织化学方法，观察缺血再灌注后的小鼠回肠nNOS和iNOS的表达及变化，探讨nNOS和iNOS在再灌注的不同时期的表达规律，有助于进一步了解IRI的机制。
本实验选用出生后21-22天的小鼠，体重9.4-16.6g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。按缺血再灌注不同时间，将36只小鼠随机分为：缺血45min再灌注1d、3d、5d、7d组(每组8只)及对照组(4只)。又将再灌注1d、3d、5d、7d组中的每一组分为实验组和假手术组(每组4只)。实验组用0.4％的戊巴比妥钠(10ml/kg)腹腔注射麻醉，75％医用酒精消毒，剖开腹膜腔，分离出肠系膜上动脉，用动脉夹夹闭分离出的肠系膜上动脉，45min后取出动脉夹，恢复血供，还原肠位，缝合切口，分别再灌1d、3d、5d、7d，建立肠的IRI模型。对假手术组的处理，除不夹闭肠系膜上动脉之外，其它步骤同实验组。对照组不作任何处理。实验前后小鼠能自由获取食物和饮水。然后分别将36只小鼠引颈处死，剖开腹膜腔，距离回盲部1cm处取长约2cm一段回肠，用4％多聚甲醛固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片厚度约7μm，贴于涂有多聚L-赖氨酸胶的清洁玻璃片上烤干待用。
采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC法)，分别检测缺血45min再灌注1d、3d、5d和7d后，nNOS和iNOS在小鼠回肠中的表达。所有切片用Olympus显微镜进行形态学观察，然后每组取5张切片，每张切片在40×10倍的光镜下随机取4个视野，图像经摄像仪拍摄并输入计算机，再经HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统分析，计算nNOS和iNOS阳性细胞分别在各组中的平均光密度。
结果提示：再灌注1d、3d、5d、7d组中的nNOS阳性细胞平均光密度明显高于对照组和假手术组(P＜0.01)，表明小鼠回肠肌间神经丛内nNOS活性增强，NO的生成增多。研究证明，NO是肠道NANC神经的抑制性神经递质，大量的NO抑制NANC时，可使肠平滑肌松驰。nNOS神经元产生的NO直接扩散到平滑肌细胞内，提高了sGC的活性，增加cGMP生成，降低游离钙浓度或降低肌细胞对钙的敏感性，引起平滑肌更进一步松驰，即改变了肠动力，导致更多的细菌和内毒素移位。由此可见，在IRI后nNOS产生的NO是有害的。在5d组中的iNOS在肌间神经丛有明显的表达(P＜0.05)，其可能的原因是与内毒素的侵入有关。7d组中的iNOS在肌间神经丛中的表达略减弱，其可能的原因是与iNOS的底物消耗有关，由此，我们也可以推测iNOS产生NO对肌间神经丛有一定的毒害作用，引起神经细胞的凋亡。因此，如果在肠缺血再灌注的3～5天内下调神经细胞中nNOS和iNOS的表达，减少NO的生成，可能会减轻缺血再灌注对肠神经细胞的损伤。