小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)为马铃薯Y病毒科Y病毒属的成员之一,是葫芦科作物重要的病原病毒之一。ZYMV单独或与其他病毒一起侵染罗汉果,引起罗汉果(Siraitia grosvenorii)病毒病。为了明确罗汉果ZYMV (ZYMV-LHG)病毒病的流行规律和侵染源,本研究开展了罗汉果全生育期田间病毒病发生情况监测,并对罗汉果田块内和周边植物进行广泛的病毒血清学检测；对来自不同罗汉果种植区的侵染罗汉果的ZYMV的外壳蛋白(CP)基因序列进行分析,以明确ZYMV-LHG在分子水平上的分化程度；同时,对罗汉果抗病毒转基因方法进行了初步探索。本研究于2006年5月、7月和9月分别对广西桂林的永福和广西柳州的融安两地的7个罗汉果果园进行了罗汉果全生育期田间病毒病发病率调查。在生长前期,宿根苗已全部发病,但组培苗均未见发病；生长中期,有宿根苗的果园的病毒病发病率已经达到100%,田间长势相对较弱,与其邻近的果园发病率也远远高于周围无宿根苗的果园。生长后期,所有罗汉果果园都能看到发病罗汉果植株,发病率从0.8%到100%不等。用提纯的ZYMV-LHG病毒粒子免疫新西兰大白兔,获得效价1：16000的抗血清。用ZYMV-LHG抗血清对罗汉果果园及周围植物进行带毒率检测,在46科96属的114种植物中,发现分别属于葫芦科、苋科、豆科、菊科、禾本科、蓼科、锦葵科、鸭跖草科和茜草科共9个科的部分植物呈阳性反应,植物阳性检出率与田间罗汉果的病情发展趋势一致,表明ZYMV-LHG有较广泛的自然寄主范围。对罗汉果种子传播ZYMV-LHG的效率进行了测定。结果表明,ZYMV不能够通过罗汉果种子进行传播或者其传播的概率很低。为了解ZYMV-LHG的进化规律,对从桂林的永福、龙胜和兴安三个县的15个果园采集的表现典型花叶病症状罗汉果的ZYMV-LHG的不同分离物进行了基因序列分析。以病叶总RNA为模板,通过RT-PCR的方法获得17条来源于独立样品ZYMV-LHG的外壳蛋白(CP)基因序列,它们的核苷酸序列同源性为92.1%-100%,氨基酸序列同源性为96.4%-100%。利用Dnasp进行分析,发现ZYMV-LHG CP基因的5’端具有较高的多样性,Tajima’s D统计值为0.44664,表明ZYMV-LHG核苷酸序列的进化为平衡选择,没有群体扩张的倾向。此外,这17条序列的蚜传保守DAG基序均未发生改变,暗示它们均可以通过蚜虫传播。线性抗原表位预测显示,在ZYMV-LHG的CP的N端,线性抗原表位发生较多变化,17个分离物可以分为6种不同的抗原类型,其中Ⅰ型最多,包括了6、7、8、9、12、N10-1和N10-4共7个分离物。用基于距离的邻近法(neighbor joining, NJ)构建系统进化树和用贝叶斯-马尔科夫链-蒙特卡洛方法(Bayesia MCMC)对ZYMV-LHG的最近共同祖先出现时间进行了估计。世界各地已报道的ZYMV的各种株系的最近共同祖先的出现时间为736年(95%HPD,256-1357年),核酸替代率为1.7×104替代／每位点／每年(95%HPD,0.723-3.11×10-4替代／每位点／每年)。MCC树分析表明,,而本研究获得的ZYMV-LHG分离物主要归于两个基因簇群,并且没有明显的杂和其他来源的病毒,ZYMV-LHG在进化上处于比较保守的位置。本研究比较了罗汉果子叶、罗汉果实生苗叶盘和罗汉果组培苗叶盘三种外植体的再生频率,发现罗汉果子叶具有再生能力强,再生效率高的特点,最适合作为罗汉果转化体系的外植体,以罗汉果子叶为外植体,60mg/L的卡那霉素(km)浓度为筛选压力。本研究所构建的罗汉果遗传转化系统,为今后罗汉果基因工程抗病毒育种奠定了初步基础。选择ZYMV的NIb和CP最保守的区域并分析它们的二级结构后,确定并获得了转基因用RNAi所需的目的片段。以pBI121为载体,构建分别携带ZYMV的NIb和CP的RNAi片段的双元表达载体pBI121ZYMVCPRNAi和pBI121ZYMVNIbRNAi。通过农杆菌介导的方法,把ZYMV的CP、NIb基因导入到罗汉果中,共获得了258棵转基因罗汉果植株,其中转pBI121ZYMVCPRNAi的转基因苗有139棵,转pBI121ZYMVNIbRNAi的转基因苗有119棵。