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为了探索LeETR1或LeETR2在番茄(Lycopersicon esculetum)乙烯受体基因家族中的功能特异性,构建了含有3’-端非编码区和35S CaMV启动子的反义LeETR1和LeETR2序列,以含反义LeETR1或LeETR2的表达载体转化番茄B1纯系,转化子经过多代筛选和鉴定,得到两个转基因株系ale1和ale2。将ale1与ale2杂交,得到杂交一代dale。以ale1、ale2和dale作为本实验的研究对象,经过标记基因NPTⅡ PCR、Southern blot分析、反义序列PCR和标记基因GUS活性鉴定均为阳性。证明转入的反义序列稳定遗传。对各株系生长发育、衰老脱落、果实成熟、乙烯合成、乙烯受体基因表达等进行了系统比较。结果如下: 1.ale1遮光幼苗上胚轴缩短增粗,自然光照下生长的植株明显矮化,显著性叶柄上位性生长,花序轴缩短,开花期和座果期都推迟,开花数和座果率下降,花朵衰老、花梗和叶柄脱落显著加速。这些性状提示乙烯受体LeETR1对番茄营养生长,生殖生长和器官衰老脱落都有重要调控作用。ale2只表现遮光幼苗上胚轴缩短、器官脱落加速和叶柄轻微的上位性生长等部分乙烯反应,提示乙烯受体LeETR2只在有限的组织中调控乙烯反应。 2.ale1果实在乙烯受体抑制剂1-MCP作用下,着色速度有所减慢;而在外源乙烯作用下,果实转色速度有所提高,提示ale1对外源乙烯和乙烯作用抑制剂敏感性提高。ale1果实果胶酶活性上升和硬度下降速度有所加快,提示乙烯受体LeETR1可能对调控果实硬度变化有一定作用。 3.转基因株系果实乙烯产量显著增加。自然后熟果实ale1和ale2乙烯产量分别是对照的3倍和5倍左右;外源乙烯处理果实ale1乙烯产量是对照的5倍,ale2和dale均是对照的2倍。转基因株系ACC含量明显高于对照株系,因此增加的乙烯产量可能与乙烯合成系统活性增强有关。 4.采用核酸酶保护分析法对乙烯受体基因家族表达模式进行了分析。在野生株系中LeETR1、LeETR2和LeETR4在转录水平的表达没有明显组织特异性,LeETR3和LeETR5主要在果实中表达,而在其它组织中很少。在转基因株系中,LeETR2在ale1离层、转色果和红熟果中表达有所增加,LeETR5在ale1果实中表达增加,提示LeETR2和LeETR5对LeETR1可能有组织特异的补偿作用。在转基因株系中相应的LeETR1或LeETR2 mRNA没有显著降低,转入的反义基因可能在转录后或者翻译水平发挥反义抑制作用,降低受体蛋白水平。 5.通过该项研究发现,番茄乙烯受体LeETR1与LeETR2在不同组织中可能有不同的相互关系。推测LeETR1和LeETR2在调控上胚轴生长上功能冗余,对器官脱落的调控既有功能冗余又有叠加效应。除此之外,在其它多项生长发育性状方面,ale1表现乙烯敏感性和乙烯反应增强,dale表现型与ale1基本一致,ale2则没有明显的增强乙烯反应性状,说明ale2在大多数组织中可能只是一个冗余存在的成员,没有直接的功能意义。LeETR1在番茄生长发育过程中对平衡乙烯反应可能具有特别重要的功能地位。