1目的本课题为广东省教育部产学研结合项目“双藤微乳凝胶剂的临床前开发研究”(编号:2012B091100486)部分研究内容。课题组拟将临床上治疗类风湿性关节炎的常用中药雷公藤和青风藤配伍,并制备成微乳凝胶新剂型,建立相应的质量评价体系,进行药效学的初步研究,开发成一种安全、有效、使用方便的微乳凝胶新剂型,为临床用药提供实验依据。本课题的实验方法和技术手段可以为更多其他外用中药有效成分的开发和研究提供新的思路和参考。2方法2.1双藤微乳凝胶制剂处方前研究对雷公藤甲素、青藤碱HPLC分析方法进行研究。考察雷公藤甲素和青藤碱的表观油水分配系数。2.2双藤微乳的制备根据油相中雷公藤甲素、青藤碱的溶解度,表面活性剂的增溶量以及助表面活性剂对微乳成型性的影响,筛选出最优的油相、表面活性剂和助表面活性剂的种类,并通过绘制伪三元相图优化空白微乳处方。通过体外经皮渗透实验、载药量考察,确定双藤微乳处方,并对双藤微乳的理化性质进行考察。2.3双藤微乳凝胶的制备对双藤微乳凝胶的制备工艺以及质量评价体系进行研究,以外观性状、体外经皮渗透速率等为指标,筛选凝胶骨架类型和用量,并确定最佳的制备工艺。2.4双藤微乳凝胶质量评价体系研究对制备成型的双藤微乳凝胶的外观性状、黏度、pH值、粒径、含量、稳定性、体外经皮渗透特性和皮肤刺激性等内容进行考察。2.5双藤微乳凝胶药效学的初步研究2.5.1对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用利用佐剂性关节炎大鼠模型,比较双藤微乳凝胶组、单用青风藤、雷公藤提取物的微乳凝胶,以及市售的醋酸泼尼松软膏对佐剂性关节炎的治疗效果。以体重足趾容积的变化、关节炎指数(AI)、动物状态观察为指标进行记录,给药组与对照组间作差异显著性t检验。2.5.2镇痛实验研究利用醋酸致小鼠扭体实验,比较双藤微乳凝胶与单用青风藤、雷公藤提取物的微乳凝胶以及市售的消炎镇痛药布洛芬软膏的镇痛效果。记录各鼠20分钟内扭体反应次数,并计算抑制率,对给药组与对照组间作差异显著性t检验。3结果3.1双藤微乳凝胶制剂处方前研究雷公藤甲素、青藤碱HPLC分析方法研究结果如下:雷公藤甲素:色谱柱为 Agilent TC-C18 ODS 柱(5μm,250mm×4.6 mm);Phenomenex保护柱;流速:1mL·min-1;流动相:甲醇-水(体积比为45:55);检测波长为218nm。青藤碱:流动相为甲醇-水(体积比为55:45),水中加入0.2%的三乙胺;检测波长为265nm。在上述色谱条件下,雷公藤甲素、青藤碱的出峰时间分别为13.8min和8.6min,峰型良好,精密度和稳定性符合分析要求,且色谱峰分离度较高,阴性对照无干扰。实验结果表明雷公藤甲素和青藤碱的油水分配系数对数值logP分别为0.69 和 1.98。3.2双藤微乳的制备通过考察不同油相中指标成分雷公藤甲素、青藤碱的溶解度,表面活性剂的增溶量以及助表面活性剂对微乳成型性的影响,筛选出最优的油相、表面活性剂和助表面活性剂分别为油酸、AEO-9和OP乳化剂(8:2)、无水乙醇;通过绘制伪三元相图优选出Km1:1、Km1:2、Km1:3、Km3:2、Km2:3、Km2:1六个成型性较好的空白微乳处方;按照0.5%的载药量和不同的Km值制备六种含药微乳,并进行体外经皮渗透实验,结果表明Km2:1的微乳为最佳处方;通过载药量考察,确定双藤微乳最大载药量为1%,最终确定双藤微乳的处方为1%药物,1.58%油酸,7.58%AEO-9,1.89%OP-乳化剂,4.73%乙醇,83.22%水。双藤微乳理化性质考察结果如下:双藤微乳为金黄色透明澄清液体;通过染色法证明双藤微乳为O\W型的微乳;通过对三批双藤微乳粒径分布的测定,结果表明其平均粒径为20.8±0.3nm,通过对三批双藤微乳的黏度进行测定,结果表明其平均黏度为11.3±0.2mpa·s;对三批微乳的pH值进行测定,结果分别为5.89、5.77、5.86,平均pH值为5.84±0.06,RSD=1.07%,证明双藤微乳为弱酸性的液体。通过离心实验考察双藤微乳的稳定性,结果表明微乳离心后仍澄清透明,未见相分离、沉淀或者浑浊等现象的出现,稳定性较好。3.3双藤微乳凝胶的制备实验结果表明,当选择卡波姆940作为凝胶骨架基质时,所制得的双藤微乳凝胶为金黄色澄清透明的凝胶状制剂,黏性较强,久置后未见浑浊,因此本实验选择卡波姆940为凝胶骨架基质,而最佳的卡波姆940浓度为2%。3.4双藤微乳凝胶质量评价体系研究双藤微乳凝胶质量评价体系研究结果如下:外观性状为金黄色且澄清透明、均匀、细腻的凝胶状制剂,稳定性良好;通过对三批双藤微乳凝胶的黏度进行测定,结果表明其平均黏度为16.3±0.1pa·s;对三批微乳凝胶的pH值进行测定,表明其平均pH值为6.14±0.07,证明双藤微乳凝胶适合经皮给药。通过对三批双藤微乳凝胶中青藤碱和雷公藤甲素含量的测定,结果表明,青藤碱的含量为5.969mg·g-1,雷公藤甲素的含量为2.993μg·g-1。通过耐热、耐寒、室温留样试验对双藤微乳凝胶的稳定性进行考察,结果表明双藤微乳凝胶外观性状良好,pH值、雷公藤甲素和青藤碱的含量无明显变化,表明双藤微乳凝胶稳定性良好。通过体外经皮渗透实验可知双藤微乳、双藤微乳凝胶中青藤碱和雷公藤甲素24h累积渗透量和经皮渗透速率均优于凝胶组,微乳中加入凝胶骨架后,青藤碱和雷公藤甲素的经皮渗透速率低于微乳组。皮肤刺激性实验结果表明,双藤微乳凝胶中的药物以及基质对完整皮肤无刺激性,但对破损皮肤具有轻度的刺激性。3.5双藤微乳凝胶药效学的初步研究3.5.1对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用双藤微乳凝胶对佐剂性关节炎大鼠的症状有明显的改善作用,强于单用雷公藤或者青风藤组,作用强度与醋酸泼尼松软膏组相似。提示两者联合应用,可减少两药的用药剂量,对佐剂性关节炎能起到良好的治疗作用。3.5.2镇痛实验研究双藤微乳凝胶组的疼痛抑制率较高,在所用的配伍剂量下对醋酸致小鼠扭体疼痛抑制的增强作用不明显。