研究背景及目的肾脏细胞癌在成人肿瘤中占3%,占肾脏恶性肿瘤的85%左右。是继前列腺癌和膀胱癌之后的第三位泌尿系肿瘤,具有非常高的死亡率,大约40%。透明细胞癌是肾脏细胞癌中最常见的亚型,约占全部肾细胞癌的70-80%。除了外科手术切除之外,肾细胞癌对化疗及放疗均不太敏感。目前由于缺乏早期诊断及后期随访的有效生物标记物,导致部分疾病被发现时已经是晚期或者出现转移而预后不良,转移患者5年生存率低于25%。因此,加强对肾透明细胞癌转移机制的研究显得非常急迫而重要,试图找到能够预测术后早期转移和病情进展的生物标记物及抑制癌细胞转移的方法势在必行。目前,由于基因组测序相关技术的飞速发展,非编码RNA转录本冲击着研究者的视野,部分非编码RNA被发现在肾癌疾病发生发展中扮演着重要的作用,特别是长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的出现,在基因表达调控、染色体修饰等过程中发现了以前未被认识的功能。基于肿瘤分子生物学特点的最新研究进展,较好的方法之一是对例lncRNA表达谱的分析及相关研究。逐渐揭示lncRNA在肿瘤发病与进展中的功能和作用。研究方法(1)肾透明性细胞癌组织样本测序:对伴有淋巴结或远处转移的肾透明细胞癌3例与不伴淋巴结和远处转移的肾透明细胞癌3例测序,分析出表达差异长链非编码RNA(lncRNA)。(2)扩大临床样本对筛选的长链非编码RNA进行验证,筛选出差异表达最明显的长链非编码RNA。(3)临床样本中验证筛选出的长链非编码RNA与肾透明细胞癌转移的相关性。(4)进行lncRNA干扰序列的设计与过表达全长的扩增。设计出干扰序列进行细胞转染,同样采用荧光定量PCR法,获取Cp值,检验干扰效率,干扰效率达到70%左右视为干扰有效。(5)lncRNA功能实验:选取两种肾脏透明细胞癌系,分别干扰和过表达LncRNA后行细胞侵袭、转移、增殖、凋亡等功能性研究。采用样本均数t检验、重复测量等统计方法分析差异表达情况。(6)体内实验:干扰或过表达lncRNA后,包装慢病毒,转染肾透明细胞癌系细胞,裸鼠尾静脉注射,研究肾透明细胞癌体内转移特点。观察肾细胞癌转移的成功率。(7)干扰或过表达lncRNA后,通过生物学信息分析、查找文献或测序寻找lncRNA的靶蛋白或靶基因,进行转移机制研究。分析出转移机制中与lncRNA具有相关性的靶蛋白或靶基因。研究结果(1)成功筛选出与肾透明细胞癌转移相关的长链非编码RNA,命名为MRCCAT1(metastatic renal clear cell carcinoma-associated transcript 1)。扩大的临床样本验证实验结果显示MRCCAT1在转移性肾透明细胞癌中高表达,并且其表达量与患者预后负相关。(2)临床样本中发现,MRCCAT1和NPR3在肾透明细胞癌组织中的表达的负相关性。(3)上调MRCCAT1可以增加肾透明细胞癌细胞系的增殖、转移及侵袭能力,下调MRCCAT1则可以使肾透明细胞癌细胞系的增殖、转移及侵袭能力下降。(4)在裸鼠体内转移模型实验中进一步证实了下调MRCCAT1可以降低肾透明细胞癌细胞体内转移能力。(5)联合MRCCAT1和NPR3过表达实验结果证实NPR3为MRCCAT1下游靶基因,同时明确了MRCCAT1通过抑制NPR3参与了P38-MAPK通路。(6)MRCCAT1通过抑制NPR3进而促进肾透明细胞癌细胞系的转移能力。MRCCAT1通过与EZH2结合促进H3K27甲基化进而抑制NPR3启动子区域。结论MRCCAT1通过与EZH2结合进而抑制NPR3表达并参与了P38-MAPK通路,最终促进肾透明细胞转移。高表达MRCCAT1的肾透明细胞癌病人预后不良。因此,MRCCAT1有可能成为肾透明细胞癌转移的标志物及治疗靶点。