【摘 要】
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目的:以AB4为研究对象,通过建立体内高脂饲料喂养联合链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病肾病（DN）模型,观察AB4对DN的治疗作用;建立体外高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）模型探究AB4诱导线粒体自噬的作用及机制;明确AB4降低细胞外基质是否与其促进线粒体自噬有关。方法:1.采用高脂饲料喂养联合STZ(60mg·Kg-1)腹腔注射诱导建立DN模型并随机分组给药,每天干预给药2次,腹腔注
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目的:以AB4为研究对象,通过建立体内高脂饲料喂养联合链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病肾病（DN）模型,观察AB4对DN的治疗作用;建立体外高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）模型探究AB4诱导线粒体自噬的作用及机制;明确AB4降低细胞外基质是否与其促进线粒体自噬有关。方法:1.采用高脂饲料喂养联合STZ(60mg·Kg-1)腹腔注射诱导建立DN模型并随机分组给药,每天干预给药2次,腹腔注射连续给药8周,第1、5和8周检测大鼠血糖以及收集尿液样本检测尿蛋白,8周后,检测血清中血肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、血清总白蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）含量;糖原染色（PAS）检查肾脏病理学变化;马松染色（Masson）检测肾脏组织纤维化程度;免疫组化和Western Blot法检测细胞外基质（EMC）中纤连蛋白（FN）和肾脏Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）表达情况;采用化学试剂盒评检测血清中氧化指标过氧化氢酶（CAT）以及超氧化物歧化酶（SOD）;Western Blot法检测自噬相关蛋白P62和LC3。2.采用高糖（HG）（25 m M）的培养基刺激的大鼠肾小球系膜细胞作为体外模型。首先使用CCK8法检测AB4对HBZY-1细胞活力的影响;ELISA检测HBZY-1上清液中的水平,采用荧光定量PCR和Western-blot检测HBZY-1中的FN和ColⅣm RNA和蛋白的表达;采用细胞流式技术检测HBZY-1中氧化指标活性氧（ROS）的变化;透射电镜技术检测线粒体自噬体的表达;激光共聚焦检测线粒体膜电位（JC-1）;Western Blot检测HBZY-1细胞线粒体上PINK1、Parkin、P62及LC3蛋白的表达水平。3.自噬/线粒体抑制剂（3-MA）对高糖诱导的HBZY-1细胞中FN和ColⅣ表达的影响;对ROS、JC-1、线粒体自噬小体影响;对HBZY-1线粒体中的P62及LC3蛋白的表达水平的影响。结果:1.与正常组大鼠相比,DN组大鼠尿白蛋白排泄、肌酐、尿素氮均明显升高,而给予AB4干预后,尿白蛋白排泄、肌酐、尿素氮指标明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。病理结果显示阳性组和AB4各剂量组球囊黏连、基质增生、肾小管扩张以及肾小球纤维化有所减轻;Western Blot和免疫组织化学结果显示AB4能明显降低细胞外基质（FN,ColⅣ）蛋白的表达;Western Blot结果显示AB4使DN大鼠LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化升高以及降低P62的表达。2.ELISA结果显示AB4能明显降低HBZY-1细胞中FN和ColⅣ的表达,荧光定量PCR和Western Blot结果表明AB4可以降低HBZY-1细胞中FN和ColⅣ蛋白和m RNA的表达;AB4可抑制细胞内活性氧的释放;抑制线粒体膜电位的丧失;使线粒体自噬小体增多,使自噬水平增强;在细胞水平上,AB4对线粒体自噬通路相关蛋白的表达具有一定的调节作用,明显增强组织和细胞中的PINK1、Parkin和LC3以及抑制P62蛋白表达;同时可增强HBZY-1细胞线粒体上PINK1、Parkin和LC3和抑制P62蛋白表达。而经自噬/线粒体抑制剂（3-MA）处理HBZY-1后,AB4对HG损伤HBZY-1细胞的保护作用被抵消。结论:1.AB4对糖高脂饲料喂养联合STZ诱导建立的DN有保护作用;2.AB4可能通过的PINK1-Parkin通路升高线粒体自噬水平;3.AB4降低细胞外基质保护DN大鼠的作用机制可能与其促进线粒体自噬有关。
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