副粘病毒是一类对人和动物致病的重要病毒,在世界范围内流行,分为两个亚科:副粘病毒亚科和肺病毒亚科。副粘病毒亚科包括副粘病毒属、麻疹病毒属和腮腺炎病毒属;副粘病毒属主要包括人副流感病毒(hPIV)、新城疫病毒(NDV)和仙台病毒(SV),麻疹病毒属主要包括麻疹病毒(MV),腮腺炎病毒属主要有流行性腮腺炎病毒(MuV)。肺病毒亚科只包括肺病毒属,主要有人和牛呼吸道合胞病毒(RSV)。副粘病毒能够引起人类呼吸系统和生殖系统疾病,如上呼吸道感染、支气管炎、毛细支气管炎、肺炎、结膜炎、睾丸炎、卵巢炎等等,严重时甚至引起死亡。其中,MV、MuV、RSV等能引起儿童常见病,如麻疹、流行性腮腺炎以及呼吸道感染等。人副流感病毒3型(hPIV3)是婴幼儿毛细支气管炎和肺炎的第二大病因,还可引起婴幼儿的哮吼和喉炎。目前尚无有效的抗hPIV3治疗措施。除感染人类外,副粘病毒还能感染动物如禽类、马类、猪类等。NDV是重要的禽类传染病病原体,往往引起灾难性的、广泛流行的疾病。此外,NDV尚有一定的临床意义,如诱导干扰素(IFN)、免疫调节、肿瘤治疗等。近年发现的一些病毒,如尼帕病毒、亨德拉病毒、Salem病毒、鸟类肺炎病毒(APV)、人类后肺炎病毒(hMPV)等,都属于副粘病毒科。这些病毒能引起严重的人类和动物疾病,可以感染许多器官中的血管和血管外实质,还能引起严重的中枢神经系统疾病。临床上主要表现为发烧、头痛,病死率极高。1998年新加坡和马来西亚暴发类亨德拉病毒感染,导致上百人死亡。这种病毒来源于猪,和来源于马的亨德拉病毒相似。细胞融合是多种病毒增殖、扩散和致病过程中不可缺少的一步。除了副粘病毒以外,许多人类重要的致病病毒都含有细胞融合作用的包膜糖蛋白,如单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等。因此,对副粘病毒细胞融合进行研究具有广泛的意义。副粘病毒属于单股负链RNA病毒,核衣壳外有包膜。基因组为15kb左右的不分节段RNA,主要编码6种病毒蛋白:核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、内膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、吸附蛋白、大分子量RNA聚合酶(L)。其中NP、P、L蛋白与基因组有关,共同参与病毒RNA的转录,以形成有活性的mRNA;吸附蛋白、F、M与病毒包膜有关,吸附蛋白和F蛋白形成刺突,是重要的保护性抗原,M蛋白构成病毒包膜内表面的支撑物。吸附蛋白在不同病毒属具有不同的活性:在hPIV、NDV、MuV具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,称为HN蛋白;在MV只有HA活性,没有NA活性,称为H蛋白:在RSV既无HA活性,也无NA活性,称为G蛋白。HN蛋白为同源四聚体,基因长度大约为2 100个核苷酸(nt),编码的蛋白以N-末端插入膜内,主要分为4部分:亲水的胞内尾巴(CT)、疏水的穿膜区(TM)、颈部和头部;主要负责3种功能:(1)受体结合活性;(2)NA活性;(3)促细胞融合活性。副粘病毒感染宿主细胞过程中,膜融合是整个过程的第一步,也是至关重要的一个环节,由HN和F蛋白共同负责完成。感染过程中病毒通过HN蛋白与宿主细胞表面受体结合,引起HN蛋白构型改变。与HN蛋白相连的F蛋白构象随之发生变化,七重复基元(HR)HR1与HR2相互作用形成稳定复合体,使病毒包膜和宿主细胞膜靠近,同时融合肽(FP)暴露并嵌入到宿主细胞膜中而启动膜融合。在这个过程中,F蛋白是主要的调节蛋白,但单独的F蛋白并不能引起膜融合,必需有同源性HN蛋白辅助。HN蛋白的促细胞融合作用在副粘病毒中具有极强的特异性,即F蛋白只有与同源性HN共表达时才能完成细胞融合这一过程,而与异源性HN共表达时则不能引起细胞融合。例如,NDV F和NDV HN共表达或hPIV3 F和hPIV3 HN共表达时,有细胞融合发生;而NDV F和hPIV3HN共表达或hPIV3 F和NDV HN共表达时,则不能发生细胞融合。这表明在HN蛋白和F蛋白间存在着特异性的相互作用。HN蛋白促细胞融合区域是副粘病毒研究热点之一。为了寻找副粘病毒HN蛋白分子中与同源F蛋白相互作用的特异性区域,弄清HN蛋白促细胞融合作用的分子机制,我们采用基因定点突变和基因重组的方法对NDV HN和hPIV3 HN的cDNA进行定点突变并构建各种嵌合体(chimera),然后与同源或异源性F蛋白于真核细胞BHK21内共表达,测定细胞表面HN蛋白的表达和细胞融合情况。结果表明hPIV3 HN蛋白中促细胞融合区域位于TM区中部到胞外区起始的第82个氨基酸间的区域。再次研究发现嵌合时引入了1个糖基化位点,此糖链对hPIV3HN蛋白促细胞融合活性有抑制作用。除去此糖基化位点后再次嵌合将HN蛋白促细胞融合区域缩短了10个氨基酸,定位于TM区中部到胞外区起始的第72个氨基酸间的区域。NDV HN蛋白促细胞融合区域也定位于相同的区域。研究发现副粘病毒HN蛋白促细胞融合区域两端各含有一个保守的亮氨酸拉链,一个位于TM区,另一个位于颈部近膜区。通过定点突变发现NDV HN蛋白的这两个亮氨酸拉链对于蛋白的促细胞融合作用有重要影响。TM区亮氨酸拉链中的保守氨基酸L30、L37和L44突变后对蛋白转运并没有影响,但蛋白的促细胞融合活性都有所降低,尤其是L44突变和L30、L37联合突变。颈部近膜区亮氨酸拉链中的保守氨基酸L96、L103和L110突变后HN蛋白促细胞融合能力同样明显降低。在hPIV3 HN蛋白的促细胞融合区域两端同样存在两个亮氨酸拉链,但目前尚未见相关的研究报道。本研究在原有工作的基础上,利用定点突变技术构建hPIV3 HN蛋白促细胞融合区域两端亮氨酸拉链中的保守氨基酸突变体,然后检测突变体与同源F蛋白共表达后的促细胞融合活性以及受体结合活性、细胞表面表达效率,从而确定亮氨酸拉链对hPIV3 HN蛋白功能的影响。一、TM区亮氨酸拉链突变体对促细胞融合活性的影响hPIV3 HN蛋白TM区亮氨酸拉链由氨基酸L36～I50组成,其中L36、L43和I50等氨基酸在副粘病毒中高度保守,采用同源重组PCR方法进行定点突变构建突变体。每个突变体需要设计两对含同源序列的引物,进行两次PCR。获得的两个PCR产物含有短同源末端序列,将其同时转染大肠杆菌TG1后,二者会自动重组形成完整的含突变位点的质粒。为避免引入额外突变,引物中未引入酶切位点。转染后提取质粒,电泳结果正确,经测序证实引入突变,成功将各保守氨基酸突变为丙氨酸(A)。由此得到3个单独突变体,分别命名为:L36A、L43A和I50A。在单独突变的基础上,构建1个联合突变体,命名为L36A-L43A。将突变体分别转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞,采用定性(Giemsa染色)和定量(指示基因法)两种方法检测细胞融合情况。细胞融合功能经校正后,消除了蛋白表达效率的影响。结果显示,与野生型(wt)hPIV3 HN基因相比,各单独突变体促细胞融合活性有不同程度的降低。以wt HN基因促细胞融合活性为100%,突变体L36A融合活性为wt HN基因的66.66%,突变体L43A融合活性为wt HN基因的60.60%,突变体I50A融合活性为wt HN基因的57.60%。联合突变体L36A-L43A转染后未见细胞融合形成。hPIV3 HN蛋白颈部近膜区的亮氨酸拉链由氨基酸L114～I128组成,其中L114、L121和I128在副粘病毒中高度保守。采用同源重组PCR方法进行定点突变。突变后提取质粒后电泳结果正确,经测序证实成功引入突变。由此得到3个单独突变体,分别命名为:L114A、L121A和I128A。在单独突变的基础上,构建1个联合突变体,命名为L121A-I128A。将突变体分别转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞,采用定性(Giemsa染色)和定量(指示基因法)两种方法检测细胞融合情况。受体结合活性经校正后,消除了蛋白表达效率的影响。以wt hPIV3 HN基因促细胞融合活性为100%,L114A促细胞融合活性为wt HN基因的53.00%,L121A促细胞融合活性为wt HN基因的59.10%,I128A促细胞融合活性为wt HN基因的90.90%。联合突变体L121A-I128A转染后未观察到细胞融合。颈部亮氨酸拉链附近及内部的氨基酸P111、I112和I125在副粘病毒中亦是保守位点。同样以同源重组PCR方法获得3个单独突变体,分别命名为:P111A、I112A和I125A。将突变体分别转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞,采用定性(Giemsa染色)和定量(指示基因法)两种方法检测细胞融合情况。促细胞融合活性经校正后,消除了蛋白表达效率的影响。以wt hPIV3 HN基因促细胞融合活性为100%,P111A为wt HN的43.90%,I112A为wt HN的39.40%,I125A为wt HN的34.80%。各突变体分别进行3次平行实验,所得实验数据采用秩和检验进行分析;秩和检验统计值H=28.78,P＜0.05,表明各突变体促细胞融合活性差别有统计学意义,其中突变体I125A活性最低,突变体I128A活性最高。FACS分析表明,各突变体都成功在细胞表面表达,但与wt HN基因相比,表达效率有所降低。二、亮氨酸拉链突变体对受体结合活性的影响将上述获得的11个突变体L36A、L43A、150A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A、I125A、L36A-L43A和L121A-I128A分别转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞,采用血吸附实验检测突变体的受体结合活性。受体结合活性经校正后,消除了蛋白表达效率的影响。结果表明各突变体对受体结合活性影响较小。与wt hPIV3 HN基因相比,TM区亮氨酸拉链的3个突变体中,突变体L36A受体结合活性和wt HN基因一样,为100%,而突变体L43A和I50A受体结合活性稍低,分别为wt HN基因的98.99%和91.92%。颈部近膜区亮氨酸拉链的3个突变体L114A、L121A和I128A受体结合活性分别为wt hPIV3 HN的95.96%、92.93%和100%。此外,突变体P111A为wt HN的97.98%,I112A为wt HN的95.96%,I125A为wt HN的85.86%。两个联合突变体受体结合活性也与wt HN基因接近,L36A-L43A受体结合活性为wt HN基因的95.96%,L1121A-I128A为wt HN基因的93.94%。各突变体分别进行3次平行实验,所得实验数据采用秩和检验进行分析。秩和检验统计值H=17.99,P＞0.05,表明各突变体受体结合活性差别不存在统计学意义。三、F蛋白对HN蛋白受体结合活性的影响将上述11个突变体分别与F蛋白共转染痘苗病毒vTF7-3预感染的BHK21细胞,采用血吸附实验检测突变体的受体结合活性。以wt HN基因受体结合活性为100%,突变体L36A受体结合活性最高,为wt HN基因的99.14%,突变体I125A受体结合活性最低,为wt HN的84.48%。采用秩和检验分析HN单独表达(血吸附HN组)与HN和F蛋白共表达(血吸附HN+F组)两组受体结合活性的差别,结果H=108.00,P＜0.05,表明两组存在差别,血吸附HN组受体结合活性比血吸附HN+F组高。从本实验结果可得出结论:本实验成功构建了hPIV3 HN蛋白TM区和颈部近膜区两个亮氨酸拉链中保守氨基酸的突变体,共获得突变体11个,其中9个单独突变体,分别为L36A、L43A、I50A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A和I125A:在单独突变的基础上构建了两个联合突变体,L36A-L43A和L121A-I128A。TM区和颈部近膜区两个亮氨酸拉链对于hPW3 HN蛋白促细胞融合活性具有重要的作用。其中的保守氨基酸突变后,促细胞融合活性均有不同程度的降低,最低的为突变体I125A,仅为wt HN的34.80%,而突变体I128A融合活性最高,为wt HN的90.90%。其它突变体融合活性在39.40%～66.66%之间。而两个联合突变体转染后未见细胞融合形成。这进一步证明hPIV 3 HN蛋白促细胞融合区域不是位于头部,而是位于TM区和颈部近膜区,并在氨基酸I125结尾,I125是对促细胞融合活性有着关键作用的氨基酸残基;亮氨酸拉链结构的完整性是副粘病毒细胞融合所必需的,对HN蛋白促细胞融合作用有着重要的影响。HN蛋白促细胞融合区域两端亮氨酸拉链对受体结合活性并无影响。各突变体受体结合活性与wt HN非常接近;突变体I125A受体结合活性为wt HN的85.86%,其它突变体在91.92%～100%之间。与HN蛋白单独表达相比,F蛋白和HN蛋白共表达能够一定程度的降低HN蛋白的受体结合活性。