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癌干细胞（CSCs）与癌症转移、侵袭、恶性转变等行为相关,被普遍认为是化/放疗抗性和癌症复发的重要根源。为了更加针对性地研究其作用机制,需要分离或富集出CSCs。近年来随着三维细胞培养技术的发展,水凝胶因具有广阔的生物医学应用前景而成为当下研究的热点之一。细胞外基质相当于一个多组分的凝胶体系。本论文以甲基乙烯基醚-马来酸交替共聚物[P（MVE-alt-MA）]为主要原料,构造了基于P（MVE-alt-MA）的三个可控的凝胶体系,仿造细胞外基质结构和性质的特点,从基质的硬度、形貌、成分及粘附性等方面进行调节,试图揭示这些因素对卵巢癌CSCs干性表达的影响。凝胶的结构通过扫描电镜、红外、溶胀率和流变等手段进行了充分的表征。首先构建最简单的聚乙二醇（PEG）交联的P（MVE-alt-MA）凝胶体系（简写为PEMM）,并在此基础上加入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）以仿造细胞外基质中胶原的性质。另外,加入海藻酸盐以模拟细胞外基质中透明质酸,从组分上更进一步地仿造细胞外基质的性能。应用这些仿细胞外基质的可控的凝胶体系实现了对单一因素进行精确且独立的调控,并研究其对CSCs干性表达的影响,最终筛选出CSCs干性基因高表达的细胞进行体内成瘤实验,初步探究肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路的作用机制。具体而言,主要工作内容包括:（1）PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶的弹性模量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。通过控制交联密度制备两种硬度的PEMM凝胶（12 k Pa和97 k Pa）,随着交联度的增加,凝胶的网络结构越紧密,弹性模量越大,溶胀率越低。细胞的增殖和活力检测证实了该凝胶良好的生物相容性,并且凝胶的特性利于SK-OV-3卵巢癌细胞的球状体形成。联合多种CSCs标志物及耐药性检测分析显示凝胶培养的球状体细胞获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,且较软凝胶中尤为显著。同时肿瘤侵袭、迁移以及恶性转变等信号通路相关基因的表达揭示了基质硬度参与调节上皮间充质转化（EMT）、白细胞介素-6（IL-6）以及Wnt等信号通路,影响卵巢癌侵袭性、EMT以及非CSCs向CSCs转变的能力。相对2D培养板及97 k Pa硬基质来说,12 k Pa软基质、大孔径形貌、高溶胀性凝胶PEMM-1中卵巢癌细胞的干性及恶性程度更高。此项研究为后续工作奠定基础,为研究基质因素对癌干细胞样细胞富集的影响提供了平台。（2）PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶中RGD含量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。在PEMM凝胶基础上通过控制RGD含量制不同表面粘附特性的凝胶,发现细胞行为受基质表面RGD含量的影响,低RGD含量表面培养的3D细胞聚集体获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,而高RGD含量表面的细胞铺展明显,药敏性增高。另外低浓度的RGD并未改变基质硬度对CSCs富集的效应关系,而基质硬度的差异对癌细胞行为的影响在高浓度的RGD凝胶中不再明显。并且较硬凝胶中RGD的存在对于癌细胞行为的影响没有软凝胶中的显著,基质硬度影响了RGD的功能发挥。卵巢癌细胞与基质表面的RGD结合,涉及到基质表面细胞的粘附程度影响其形态和分化状态,进而影响其癌细胞干性的表达以及EMT等过程。高RGD表面Snail、MMP9、IL-6和Wnt1下调,影响了卵巢癌侵袭性、CSCs干性的获得及非CSCs的转化相关信号通路。说明了RGD含量和基质硬度共同作用于CSCs干性、EMT、IL-6和Wnt通路的表达。（3）PEG交联的P（MVE-alt-MA）和海藻酸盐双网络凝胶对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。制备了三种双网络凝胶,其由PEMM形成的第一重网络以及阳离子（Sr2+、Ca2+或Fe3+）交联的海藻酸盐形成的第二重网络（Sr Alg、Ca Alg或Fe Alg）所构成。对双网络凝胶的硬度、形貌和成分进行系统的研究,以了解其对CSCs富集的影响。经检测发现仅PEMM/Fe Alg凝胶可供细胞长期生长增殖,且利于SK-OV-3细胞的球状体形成。同时PEMM/Fe Alg凝胶培养的球状体细胞获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,且PEMM-I/Fe Alg凝胶尤为显著,而不同时间点CSCs标志物的变化也说明了其各自的作用阶段。基质成分、硬度和形貌共同参与调节EMT、IL-6以及Wnt等信号通路,影响卵巢癌的侵袭性以及非CSCs向CSCs的转化。PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶中海藻酸盐的加入既能改变基质成分,又可通过调控双网络结构进而引入离子并改变基质硬度和形貌,是较为理想的研究模型。（4）基于P（MVE-alt-MA）的凝胶富集的卵巢癌干细胞样细胞的致瘤性评价。通过从凝胶基质的成分、硬度、形貌及粘附特性等方面对卵巢癌干细胞样细胞富集影响的研究,初步筛选出利于CSCs富集的培养环境,并从中选取CSCs标志物表达较高、耐药性较强、恶性通路激活较显著的PEMM-1和PEMM-I/Fe Alg凝胶培养的细胞进行致瘤性评价。由接种的细胞量、成瘤所需的时间以及瘤体的重量和体积表明,即便凝胶培养组的细胞接种量（1×105）比2D对照组的（1×106）少一个数量级,但其成瘤较快,瘤体也更大,且CSCs干性的表达依然增强,进一步证实了基于P（MVE-alt-MA）的凝胶富集的癌干细胞样细胞中CSCs比例的增高。综上所述,本研究构造仿细胞外基质的不同种类的凝胶体系,系统探讨了凝胶的各种因素对肿瘤细胞行为的影响,进而达到对CSCs的富集,为体外肿瘤病理分析提供了更多的研究模型和研究平台。