淫羊藿多糖的提取纯化、化学修饰及抗NDV活性研究

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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)严重危害了各国养禽业的发展。目前国内外均采用疫苗免疫接种进行预防,尚无有效的治疗药物,而中药多糖在治疗新城疫疾病方面显示出巨大的潜力。本试验在初步筛选出的具有抗新城疫病毒活性的中药多糖的基础上,以淫羊藿多糖(Epimedium polysaccharide,EPS)为研究对象,开展了如下研究内容:在单因素考察的基础上,用正交实验优选EPS超声提取法和超声协同酶提取法的提取条件,超声提取法最优提取条件为:时间为50min,物料比为1∶20,温度为60℃;在该条件下采用苯酚-硫酸法测得EPS的提取率为24.12%,含量为0.56%;超声协同酶法所最优提取条件为:酶含量0.210g,时间为30min,pH值为9,温度为70℃,EPS提取率为45.23%,含量为1.06%。发现超声协同酶提取法优于超声波提取法。比较了Sevag法、反复冻融法、反复冻融结合Sevag法三种除蛋白的效果,选出最佳的方法是反复冻融结合Sevag法。用DEAE-52分离EPS可以得到两个洗脱峰。在对氯磺酸-吡啶体积比、反应时间、反应温度单因素考察的基础上,以SO42-含量和硫酸基取代度(DS)为指标,正交实验优选EPS的氯磺酸-吡啶法硫酸化修饰条件,所得最适硫酸化条件为:体积比为1∶6,反应时间为2.5h,反应温度为60℃;在该条件下所得多糖的SO42-含量为13.57%,DS为1.22。经紫外光谱分析,在190~220nm处有一强吸收峰,为多糖类物质吸收峰,在250~275nm之间有明显的-SO3的特征吸收峰。红外光谱分析结果表明硫酸酯化是成功的,EPS和硫酸酯化淫羊藿多糖(sulfated EPS,sEPS)均具有多糖母体的特征吸收峰,sEPS还有1259cm-1左右的S=O特征吸收峰和787cm-1左右的C-O-S特征吸收峰。体外细胞培养MTT法结果表明硫酸酯化后EPS的抗病毒活性有明显的提高,尤其是先加多糖后加病毒和病毒多糖同时加入这两种方式,EPS原来的抗病毒活性较低,硫酸酯化后活性显著提高。而sEPS可以干扰病毒对宿主细胞的吸附,影响病毒的释放而起到抗病毒的作用,还具有一定的直接杀灭病毒作用。本研究优化了EPS的提取条件,找到了合适的除蛋白方法,选择了适宜的硫酸化方法及条件,比较了EPS及sEPS抗新城疫病毒的活性,及初步探讨了抗新城疫病毒的机理。为中药多糖及硫酸酯化多糖在临床预防和治疗新城疫疾病研究提供一定的理论基础。
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