研究背景：上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在恶性肿瘤侵袭转移过程中的重要作用及其与肿瘤微环境之间的相互关系一直是近年来研究热点。EMT的概念最早在成人和胚胎上皮中发现了细胞表型和间质状态等EMT相关的变化,由Garry Greenburg与Elisabeth Hay提出,国外研究发现上皮-间质转化不但参与组织分化和胚胎发育过程,而且在肿瘤的浸润转移、组织修复、以及器官纤维化过程中发挥重要作用。除了细胞形态学上的改变,EMT还可以诱导干细胞特性、阻止自身细胞的凋亡、增强细胞侵袭能力、抗衰老功能、以及诱发产生免疫抑制等,并能使细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相关的成分产生增多。在EMT过程中,上皮细胞发生了一系列生物学改变：如消失极性、丧失胞间联系、骨架重塑、游走或上皮细胞表型标志物的表达变化：如E-钙黏蛋白(E-cadherin)、p-连环蛋白(p-Catenin)、紧密连接蛋白、细胞角蛋白等的表达缺失和间质细胞标志物：如波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白、N-钙黏素(N-Cadherin)等表达增强,从而转化为具有间质特点的间质样细胞,这些特征性改变使细胞获得侵袭或运动表型,因此发生上皮-间质转化的肿瘤细胞更具有原位侵袭和远处转移能力、对化疗药物及靶向药物的敏感性降低。近年来,乳腺癌发病率不断提升,虽然治疗手段也随之相应提高,但仍有约25%～35%的病例发生转移并导致治疗失败。在临床治疗过程中,诊断相同的乳腺癌病例,其临床预后往往差别很大,造成这种患者预后不同的原因是肿瘤的生物学异质性。研究发现EMT标记物表达在个体和群体水平都与乳腺癌预后不良相关,诱导乳腺上皮细胞发生EMT后,可以表达肿瘤干细胞表型,并且肿瘤的EMT还与肿瘤化疗耐药相关,促进多药耐药基因(multidrug resistance gene 1, MDR1)的表达。研究表明,基底样表型的乳腺癌细胞可诱发EMT发生,包括：Vimentin的上调、E-caherin向N-Cadherin的表达、细胞骨架重组等；乳腺癌细胞EMT过程与Snail的高表达有关,并且P13K/Akt:这一信号通路在乳腺癌细胞EMT过程中非常重要；研究发现,在乳腺癌组织中,NF-κB p65异常活化,它的高表达与乳腺癌的发生、发展有着密切关系,在乳腺癌的发生及恶性进展过程中起着重要的促进作用。色素上皮衍生因子(PEDF、Pigment epithelium-derived factor)是一个能有效抑制新生血管形成的蛋白,PEDF不但作为一个抗血管生成因子来抑制肿瘤的生长,而且外源性或细胞表面的PEDF也直接与细胞外基质相互作用来阻止肿瘤细胞转移。最近研究发现PEDF蛋白可以通过抑制间质蛋白水解和形态学改变来抑制黑色素瘤肿瘤细胞的外渗,表明PEDF也直接与细胞外基质相互作用来阻止肿瘤细胞转移,在肿瘤微环境中促进了肿瘤细胞的凋亡,导致了内皮细胞的凋亡。最新实验研究表明,PEDF蛋白通过层粘连蛋白受体AKT/ERK通路调低纤维连接蛋白,来抑制乳腺癌的转移,表明PEDF蛋白可能具有双重作用来抑制乳腺癌的生长和转移,从而开辟了一条阻止乳腺癌进展的新途径。国内外目前对EMT相关的促进因子、转录因子均有所研究,尤其是在乳腺癌方面,金属蛋白酶、miRNA等在调控EMT方面取得了一定的研究进展,但是寻找一个靶向基因研究其在乳腺癌调控EMT的方面研究甚少。此研究首次探讨PEDF蛋白在乳腺癌中表达与乳腺癌上皮间质转化的关系及其在乳腺癌浸润转移中的作用,与Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB这几种蛋白质的联合检测利于评估肿瘤的生物学行为及预后,有助于对指导乳腺癌的治疗和提高疗效。观察PEDF是否通过介导乳腺癌细胞发生上皮-间质转化来参与乳腺癌的浸润转移,这一发现将为乳腺癌寻找新的治疗药物和作用靶点奠定基础。第一部分PEDF蛋白在乳腺癌中的表达及其与EMT相关性研究研究目的：1.通过对乳腺浸润性导管癌组织标本中PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、 NF-κB表达研究,检测PEDF基因是否参与了乳腺癌组织的上皮-间质转化过程,并检测与乳腺癌级别、组织临床病理参数、分子分型的关系、阐明PEDF基因在乳腺癌EMT中的调节作用；研究方法：1.采用免疫组化方法检测119例原发性乳腺癌组织和30例癌旁乳腺组织中PEDF基因、间质性标记基因Vimentin、上皮性标记基因E-cadherin、转录因子Snail及NF-κB蛋白的表达,比较乳腺癌组织和正常乳腺组织中这五个指标的表达情况；分析PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白的表达与乳腺癌临床分期、分化程度及淋巴结转移的相关性；分析乳腺癌组织中E-cadherin、 Vimentin、Snail及NF-κB蛋白与PEDF蛋白的表达相关性；分析PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白与乳腺腺浸润性导管癌临床预后的关系；单因素和多因素分析PEDF、Vimentin, E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白与临床病理特征的相关性2.统计学分析：数据分析采用SPSS13.0(SPSS, Inc. Chicago, IL, USA)统计软件。使用t检验或方差分析分析PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性表达率关系,参数以x±S表示。相关分析采用Pearson或Spearman相关分析法分析分析乳腺癌组织中E-cadherin、 Vimentin、Snail及NF-κB蛋白与PEDF蛋白的表达相关性；分析PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白与乳腺腺浸润性导管癌临床预后的关系；单因素和多因素分析PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白与临床病理特征的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1. PEDF、E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性表达率分别为44.5%、49.5%、47.9%、57.1%；高表达的PEDF蛋白与低表达E-cadherin蛋白、高表达Snail蛋白、NF-κB蛋白有统计学意义的相关性,其中高表达的PEDF蛋白与低表达E-cadherin蛋白是中等相关,与高表达Snail蛋白、NF-κB蛋白是弱相关(P<0.001, r=0.496、r=0.34、r=0.383)。2. PEDF蛋白在浸润性乳腺癌中的表达与肿瘤大小相关(P=0.039)；而与患者年龄、TNM分期、组织学类型、ER受体、PR受体、腋窝淋巴结的转移无关(P=0.809、P=0.240、P=0.113、P=0.862、P=0.137、P=0.555)。Vimentin蛋白在浸润性乳腺癌中的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结的转移、PR受体、组织学类型、有统计学意义(P<0.001、P=0.017; P<0.001、P=0.008、 P=0.005)而与患者年龄、ER受体相关无统计学意义(P=0.407、P=0.248)。E-cadherin蛋白在浸润性乳腺癌中的表达与肿瘤大小、TNM分期、PR受体、腋窝淋巴结的转移相关有统计学意义(P=0.004、P<0.001、P＝0.014、P=0.013);而与患者年龄、组织学类型、ER受体相关无统计学意义(P=0.929、P=0.126、P=0.314)；Snail蛋白高表达与肿瘤大小、腋窝淋巴结的转移、TNM分期相关有统计学意义(P<0.001、P<0.001、P=0.001),而与患者年龄、组织学类型、ER受体、PR受体相关无统计学意义(P=0.775、P=0.672、P＝0.348、P=0.111); NF-κB蛋白高表达与肿瘤大小、组织学分级、腋窝淋巴结的转移状态、TNM分期相关(P=0.001、P=0.001、P=0.001, P<0.001),而与患者年龄、ER受体、PR受体相关无统计学意义(P=0.246、P=0.419、P=0.186)。3.在119例浸润性导管癌中,应用Spearman相关性分析发现：高表达Vimentin、Snail and NF-κB与E-cadherin低表达成负相关(P<0.001,r=-0.613,P<0.001, r=-0.48,P<0.001,r=-0.519).Vimentin高表达与Snai核高表达、NF-κB高表达均称成正相关(P<0.001、r=0.428; P=0.002、r=0.291).此外,PEDF高表达与E-cadherin低表达成正相关(P<0.001、r=0.496),反而与Vimentin高表达、Snail高表达、NF-κB高表达成负相关(P<0.001, r=-0.337; P<0.001, r=0.34; P<0.001,r=0.383)。4.应用Cox回归模型单因素分析确认PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail及NF-κB阳性表达(P=0.006、P<0.00、P<0.00、P=0.001、P<0.001),淋巴结转移(P=0.015),肿瘤直径(P=0.012),病理分期(P=0.012)及PR受体情况(P=0.003)为矫正其因素后有统计学意义；年龄、月经状况、组织学分级、ER状态均无统计学意义。多因素分析显示Vimentin与E-cadherin阳性表达是总生存(OS; P=0.016, HR=0.429,95%CI:0.215-0.857及P=0.004, HR＝3.274,95%CI: 1.476-7.262)有统计学意义的预后影响因素,PEDF、肿瘤直径是无疾病复发率(DFS)有统计学意义的预后影响因素(DFS;P=0.034, HR=0.723,95%CI:0.361-1.446及P=0.042, HR=1.245,95%CI:1.008-1.537)。第二部分 干扰抑制PEDF蛋白表达对乳腺癌细胞上皮间质转化及体外侵袭转移的影响研究目的通过对乳腺癌Sk-Br-3细胞系的稳定转染、稳定干扰PEDF基因乳腺癌细胞进行检测,对其增殖、侵袭和凋亡的影响来阐述PEDF基因在上皮-间质转化中的可能作用；研究方法：1.分别设计siRNA,干扰PEDF在乳腺癌Sk-Br-3细胞中表达(PEDF-siRNA);设计包装慢病毒质粒,在Sk-Br-3细胞包装和扩增(Lentivirus-PEDF-vector),然后分别将有效干扰序列转染乳腺癌Sk-Br-3细胞,采用免疫荧光染色法检测PEDF表达下调／扩增后对细胞骨架形态的影响；分析转染PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector质粒后人乳腺癌Sk-Br-3细胞PEDF蛋白表达的变化；2.通过Transwell小室法侵袭实验,检测转PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector质粒组、正常对照组和阴性对照组乳腺癌细胞的侵袭能力,分析PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector质粒转染对于人乳腺癌Sk-Br-3细胞增殖能力的影响。3.应用RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术,沉默PEDF基因,观察乳腺癌细胞体外增殖、侵袭、粘附特性的变化以及应用Western blotting技术检测人乳腺癌Sk-Br-3细胞的上皮性标记E-cadherin、间质性标志Vimentin表达的改变,探讨PEDF基因在乳腺癌上皮间质转化过程；4.应用慢病毒包装包装辅助质粒技术,扩增PEDF基因,转染乳腺癌Sk-Br-3细胞,观察乳腺癌细胞体外增殖、侵袭、粘附特性的变化以及应用Western blotting技术检测人乳腺癌Sk-Br-3细胞的上皮性标记E-cadherin、间质性标志Vimentin表达的改变,探讨PEDF基因在乳腺癌上皮间质转化过程；实验结果1.在Sk-Br-3细胞中抑制PEDF的表达和在Sk-Br-3细胞中升高PEDF的表达后进行transwell实验,结果表明PEDF可以明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。此外,在Sk-Br-3中过表达PEDF后,免疫荧光染色显示Sk-Br-3细胞骨架形态由间质样变为上皮样。2. Western blotting检测正常对照组和阴性对照细胞组的PEDF蛋白表达明显高于转染siRNA质粒细胞组的蛋白表达水平,低于Lentivirus-vector质粒细胞组的蛋白表达水平差异具有显著性(P<0.05),其中转染siRNA质粒组蛋白表达水平最低；3. Western blotting检测在Sk-Br-3中过表达PEDF后结果显示Sk-Br-3细胞中上皮细胞标志分子E-cadherin表达显著上调,而间质细胞标志分子Vimentin的表达则显著下调；反而转染PEDF-siRNA组结果显示Sk-Br-3细胞中上皮标志分子的表达显著下调,间质标志分子的表达显著上调。4.统计学分析：采用SPSS13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)统计软件。使用t检验或方差分析细胞迁徙能力和蛋白表达状况,统计描述以x±s表示。划痕创面面积不同时间及组间整体比较采用析因设计的方差分析,各单独效应分析采用单因素方差分析法。P<0.05为差异有统计学意义。