如何防治环境雌激素(environmental estrogens,EEs)双酚A(Bisphenol-A,BPA)引起的男性的生殖功能障碍,已成为国内外研究的热点问题之一。由于BPA染毒与肾虚不育在行为学改变、性腺轴形态和功能、G蛋白偶联雌激素受体(G protein estrogen receptor,GPER)在睾丸表达及补肾中药疗效等方面相关。因此,我们在前期造模成功的基础上,拟采用同位素标记相对和绝对定量技术(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)和生物信息分析方法对两者小鼠睾丸差异蛋白进行鉴定、GO和COG注释及富集和network分析,并比较差异蛋白,尤其是生殖相关蛋白的关系,以期为寻找更好的防治BPA染毒造成的生精障碍的中药提供可靠地实验依据。第一部分:BPA染毒和肾虚小鼠睾丸差异蛋白鉴定与注释目的应用i TRAQ技术和生物信息分析方法,对BPA染毒和肾虚小鼠睾丸差异蛋白进行GO和COG注释,为进一步探讨BPA染毒与肾虚小鼠睾丸差异蛋白的关系提供依据。方法1.模型制备与分组:将小鼠40只随机分为4组,每组10只。正常组(control):腹腔注射生理盐水0.2 ml,1次/d,连续7d;肾阳虚组(P1):腹腔注射氢化可的松25 mg/(kg·d),连续10d;肾阴虚组(P2):腹腔注射氢化可的松50 mg/(kg·d),连续7d;BPA组(P3):腹腔注射BPA溶液100 mg/(kg·d),连续7d。颈椎脱臼处死小鼠,取睾丸,备用。2.睾丸HE染色:制备睾丸石蜡切片。将切片经过二甲苯脱蜡,脱水,并置于苏木精溶液和伊红染色,脱水。二甲苯透明,封片。3.i TRAQ分析:还原烷基化处理提取的睾丸蛋白,充分酶解蛋白,并用Brandford法测定蛋白浓度。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取等量蛋白Tripsin酶解每个样品,用i TRAQ试剂标记肽段,并等量混合,再用强阳离子交换色谱进行预分离,最后,液相串联质谱分析得到原始质谱数据。4.质谱分析与数据处理:原始质谱数据经过相应工具转换成mgf格式文件后,用蛋白质鉴定软件Mascot比对相应数据库搜索鉴定。判断数据合格后经过一定的筛选阈值,得到最终可信的差异蛋白鉴定结果,并进行GO、COG注释。5.统计学方法:质谱数据采用Mascot2.3.02进行数据库搜索,数据库为Uniprot-Mus musculus。采用Confidence Interval>95%鉴定蛋白,至少有1个肽段与库中的肽段95%以上匹配。差异蛋白是根据蛋白质丰度水平,差异倍数在1.2倍以上,且P<0.05。结果1.睾丸HE染色:BPA、肾阳虚与肾阴虚组小鼠睾丸均出现不同程度的曲细精管腔壁变薄,基膜连续性被损坏,生殖细胞无序排列,生精上皮细胞层数减少及结构不清,腔内精子减少,间质细胞分布不均匀。2.睾丸蛋白质鉴定:共生成393967张二级图谱,23034条肽段和5803个蛋白。且重复性较好,变异程度较低,置信度高。3.睾丸蛋白定量分析:共得到肾阳虚组小鼠睾丸87个差异蛋白,表达上调27个,下调60个;肾阴虚组共177个,上调84个,下调93个;BPA组共124个,上调45个,下调79个。4.睾丸蛋白质GO注释:3个模型组小鼠睾丸差异表达的蛋白参与的生物过程23种,细胞组分16种,分子功能17种。排在前4位的细胞组分为细胞、细胞器、膜及大分子复合物等,前4位分子功能为结合、催化活性、酶调节活性及结构分子活性等,前4位生物过程主要为细胞过程、代谢过程、单一生物过程、生物调节等;并筛选出与生精功能相关的蛋白质592个,生殖过程蛋白质554个。5.睾丸蛋白质COG注释:排在前4位的是一般功能预测,翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣,复制、重组和修复,转录、翻译及核糖体结构等。结论BPA染毒与不同剂量氢化可的松经不同时间诱导的肾阳虚与肾阴虚模型小鼠均可引起睾丸形态学改变;蛋白组学研究结果初步印证了模型小鼠睾丸均存在差异蛋白表达;并筛出与生精功能相关的蛋白质有592个,参与生殖过程蛋白质有554个。第二部分:肾阳虚与肾阴虚小鼠睾丸差异蛋白的比较研究目的通过对肾阳虚与肾阴虚小鼠睾丸差异蛋白进行GO富集分析和network互作聚类分析,探讨两组差异蛋白及生殖相关差异蛋白的关系,为进一步探讨BPA染毒与肾虚小鼠睾丸差异蛋白表达的相关性提供关键的数据支持。方法1.睾丸差异蛋白GO富集分析:分别把肾阳虚组与正常组、肾阴虚组与正常组,肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白向GO数据库(http://www.geneontology.org/)各term映射,计算每个term蛋白质数目,并用超几何检验,找出差异蛋白中显著富集的GO条目。满足P<0.05为差异蛋白中显著富集的GOterm。通过显著富集于生殖或生殖过程的差异蛋白的比对,筛选出与生殖密切相关的差异蛋白。2.睾丸差异蛋白network分析:采用STRING10.5(http://www.string-db.org/)数据库预测肾阳虚组与正常组、肾阴虚组与正常组,肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白的相互作用,并绘制互作网络。选择综合置信度≥0.15时STRING数据库的数据分析模式构建蛋白质相互作用网络图。选择综合置信度≥0.7(STRING数据库默认的高置信值),并用STRING的Markov Clustering(MCL),分析蛋白质互作网络的拓扑结构,得到差异蛋白网络,对比并发现每组的节点蛋白。对从GO富集功能中筛选出的生殖相关差异蛋白进行互作分析,取综合置信度≥0.7且MCL为3时,发现生殖相关差异蛋白中节点蛋白。3.统计学方法:在富集分析中,超几何检验的P<0.05,代表差异蛋白在该条目显著富集。选择综合置信度≥0.15构建差异蛋白相互作用网络。选择综合置信度≥0.7且MCL为3时STRING数据库的数据分析模式构建差异蛋白网络模块。结果:1.肾阳虚组与正常组小鼠睾丸差异蛋白比较⑴与生殖密切相关的差异蛋白18个,其中表达上调的为Rps19、Rps28、D1Pas1,表达下调为Svs2、Svs3a、Banf1、Sod1、Rplp2、Rps5、Pdzd8、Lipe、Rplp1、Rpl11、Mif、Pebp1、Spata18、Cyp17a1及Mea1等。⑵差异蛋白中的节点蛋白共32个,分别为Hbb-b2、Hbb-b1、Ephx1、Gsta3、Eef1b2、Rps5、Rplp2、Rps28、Rplp1、Rpl11、Rps19、Ubc、Ubqln2、Hist1h3e、Hist3h2ba、H2afy、Serpina3k、Gtpbp2、Orm1、Fgb、Glb1、Akr1b8、Apoa4、Apoa1、Serpinc1、Hpx、Svs3a、Svs6、Svs4、Svs1、Svs2及Svs5等。⑶生殖相关差异蛋白中节点蛋白共8个,分别为Rplp1、Rplp2、Rpl11、Rps5、Rps28、Rps19、Svs2及Svs3a等。2.肾阴虚组与正常组小鼠睾丸差异蛋白比较及其与肾阳虚组相同的节点蛋白⑴与生殖密切相关的差异蛋白34个,其中8个差异蛋白表达上调,分别为Nme1、Vim、Calr3、Rps28、Insl3、Anxa1、Kif4及Hsd3b1等;26个差异蛋白表达下调,分别为Svs2、Ccin、Dynlrb1、Rpl35、Rplp2、Eqtn、Cabs1、Mif、Adad1、Sod1、Smcp、Izumo1、Bsg、Hspa1l、Spa17、Mea1、Smrp1、Svs3a、Banf1、Rpl23、Cabyr、Rpl11、Pebp1、Pacrg、Txndc2及Ace等。⑵差异蛋白中的节点蛋白共73个,分别为Try5、Prss1、Khsrp、Exosc5、Rpl35、Rpl23、Rpl11、Rplp2、Eef1b2、Srp9、Rps15、Rps28、Svs6、Svs3a、Svs4、Svs1、Svs2、Svs5、Col22a1、Col6a1、Eno3、Tkt、Spa17、Akap3、Cabyr、Fscb、Apoa4、Apoa1、Hpx、Fga、Fgb、Orm1、Lgals1、Anxa2、Anxa1、Gnaq、Dynlrb1、Kif3b、Kif4、Gnai2、Rapgef3、Zyx、Parva、Mphosph8、Hist1h3e、H2afy、Rbbp4、lgbp1b、Ppp4c、Srsf6、Syf2、Hnrnpul1、Lsm3、Snrpc、Snrpb、Gemin7、Ephx1、Gstp1、Adh1、Actr3、Arpc3、Nck1、Dstn、Psma3、Ubc、Ube2v2、Arhgef7、Hspb1、Mcm7、Uchl1、Chmp4b、Nedd8及Cops3等。⑶生殖相关差异蛋白中节点蛋白有7个,分别为Rplp2、Rpl11、Rps28、Rpl35、Rpl23、Svs2及Svs3a等。⑷与肾阳虚组相同的节点差异蛋白有Ephx1、Eef1b2、Rplp2、Rps28、Rpl11、Ubc、Hist1h3e、H2afy、Orm1、Fgb、Apoa1、Apoa4、Hpx、Svs1、Svs6、Svs3a、Svs4、Svs2及Svs5等。⑸与肾阳虚组相同的生殖相关节点差异蛋白为Rplp2、Rpl11、Rps28、Svs2及Svs3a。其中,与生殖相关的节点蛋白,表达上调的是Rps28,下调的是Rpl11、Rplp2、Svs2及Svs3a。3.肾阴虚组与肾阳虚组小鼠睾丸差异蛋白比较⑴与生殖相关的差异蛋白22个,其中10个差异蛋白表达上调,分别为Gpx3、Calr3、Star、Nme1、Ncapd2、Vim、Cast、Sod1、Rps4x及Cygb等;12个差异蛋白表达下调,分别为Cabyr、Selenof、Pacs1、BC048507、Ube2i、Gpx4、Smcp、Ace、Spa17、Ybx3、Odf2及Svs3a等。⑵肾阴虚组与肾阳虚组相比节点差异蛋白有37个,分别为Try5、Prss1、Setx、Scaf4、Cobra1、Ercc3、Snrpb、Cd2bp2、Lsm3、Haus4、Odf2、Ssna1、Dctn3、Dync2li1、Gm20390、Nme1、Ppid、Ttc12、Syne2、Tex12、Ube2i、Nedd8、Lcp1、Actg1、Arpc3、C4b、C3、Gnai3、Hbb-b2、Hbb-b1、mt-Atp8、Atp5j、Gpx1、Gpx3、Gpx4、Atox1、Sod1等。⑶肾阴虚组与肾阳虚组相比生殖相关节点差异蛋白为Sod1、Gpx4及Gpx3等,但因Gpx4和Gpx3不是两种肾虚的差异蛋白,而Sod1既是两种肾虚的差异蛋白,又在肾阴虚小鼠睾丸的表达高于肾阳虚,且P<0.001。结论Rps28在睾丸表达的上调和Rpl11、Rplp2、Svs2及Svs3a的下调可能是两种肾虚引起生殖障碍共同的物质基础;而Sod1在两组间的表达不同,则可能是区别两种肾虚的关键物质基础。第三部分:BPA染毒与肾虚小鼠睾丸差异蛋白的相关性初探目的对BPA组与正常组小鼠睾丸差异蛋白进行互作聚类分析,筛选BPA染毒小鼠睾丸节点差异蛋白,并予以肾虚睾丸节点蛋白进行比对,以期发现相同的节点蛋白,初步探索BPA染毒与肾虚小鼠睾丸蛋白质组的相关性。方法1.质谱分析及数据处理:同第一部分2睾丸差异蛋白network分析:同第二部分结果:1 BPA组与正常组相比节点差异蛋白有50个,分别为:Serpina3k、Orm1、Gclm、Oplah、Cyp17a1、Taldo1、Ldha、H2-Ke6、Hsd3b1、Actrt2、Arpc4、Gapvd1、Ddx21、Nat10、Rps3a、Rps17、Rpl27、Rpl17、Rps13、Rps19、Eif3g、Eif3f、Rps9、Rps10、Rps14、Kif4、Rab1、Surf4、Svs6、Svs4、Svs3a、Svs1、Svs2、Apoa1、Calr、Pdia6、Prdx4、Xpot、Ranbp1、Tnpo1、Gemin7、Snrpb、Lsm3、Hnrnpd、Psma4、Psmd7、Adh5、Aldh1a1、Gstm6及Ephx1等。2 BPA染毒与肾阴虚和肾阳虚小鼠睾丸节点差异蛋白相同的是Svs1、Svs2、Svs3a、Svs4、Svs6及Apoa1表达下调,Orm1表达上调。结论BPA染毒与肾阴虚和肾阳虚小鼠睾丸节点差异蛋白均出现Svs1、Svs2、Svs3a、Svs4、Svs6及Apoa1的表达下调和Orm1上调。因此,初步得出BPA染毒与肾虚小鼠睾丸蛋白相关的物质基础,为进一步探讨两者的相关性提供了实验依据。