前言　　人类生存繁衍的基础是生殖，生殖健康是人类健康的核心和社会文明进步的标志。不生育是影响男女双方和家庭的全球性问题。目前全球大约有15％的夫妇受到不育的困扰，其中男方因素所致不少于50％，而他们当中一半以上的患者病因不明。大量遗传学与分子生物学的研究表明，除外伤以外，人类所有疾病几乎均与基因有关。随着人类基因组计划项目的完成，人类基因的研究进入后基因组时代，其科研成果迅速应用于疾病的预防、诊断和治疗。导致特发性无精子症及严重少弱精子症的病因相当复杂，推测其中最主要的因素是遗传学改变。目前研究证实基因异常与不明原因的严重少精子和无精子密切相关，包括Y染色体微缺失、特定基因的突变或特定基因的多态性改变。为了从根本上实现对男性不育的诊疗，我们选定男性不育症相关基因为主要研究方向。目前已知Y染色体微缺失可导致特发性无精子症或严重少弱精子症;CFTR基因突变与先天性双侧输精管缺如(CBAVD)密切相关。先天性双侧输精管缺如患者占到男性不育门诊无精子症病例的1-2％以上，占到梗阻性无精子症的25％。患者除自觉精液量少之外多无其他临床表现，彩超多提示附睾网格状回声、附睾发育不良、双侧精囊腺发育不良，少数病例合并肾脏发育畸形、肾缺如。国外做了大量的CFTR基因突变与先天性双侧输精管缺如关系的研究。发现已知的CFTR基因突变1900多种，并且还在不断增加。发现先天性双侧输精管缺如的患者中75％的病例至少存在1个CFTR基因突变。其中F508del、5T和R117H是最常见的突变。但是研究显示，F508del这种高加索人最常见的突变在亚洲人中却很少出现。不同地区、不同种族之间，突变发生的情况差异很大。目前尚缺乏在中国人群中的报道，中国生育力正常人群和男性不育症患者CFTR基因突变情况尚不清楚。本研究以中国生育力正常男性和男性不育症患者（先天性双侧输精管缺如和非梗阻性无精子症患者）为研究对象，检测其CFTR基因M470V、TG-repeats、ploy-T以及CFTR基因全外显子突变情况，以明确我国生育力正常男性和男性不育症患者CFTR基因突变和多态性分布情况及其临床意义，为遗传咨询和进一步发现新的致病基因打下基础。　　材料和方法　　一、实验材料　　2008年至2012年间在中国医科大学附属盛京医院和上海医科大学附属仁济医院就诊的95例先天性双侧输精管缺如患者，入选标准:①除原发不育外无其他囊性纤维化疾病症状;②体检双侧睾丸体积正常，未触及双侧输精管;③三次精液常规检查（离心沉淀镜检）均未见精子，排精后尿沉淀亦未见精子（排除逆行射精和不射精），精液PH值呈酸性，精浆果糖及糖苷酶定量分析显著低于正常;④生殖激素检测及染色体检查均正常;⑤附睾或睾丸穿刺取到精子。同期在中国医科大学附属盛京医院就诊的67例临床诊断明确的非梗阻性无精子症患者，入选标准:①原发不育病史;②查体双侧睾丸体积正常或小于正常（小于12ml）;③三次精液常规检查（离心沉淀镜检）均未见精子，排精后尿沉淀亦未见精子（排除逆行射精和不射精），精液PH值正常，精浆果糖及糖苷酶定量分析正常;④生殖激素检测FSH正常或升高（大于12mU/ml），染色体检查正常;⑤睾丸活检病理Johnsen积分法评分2-8分。同时收集同期135例因女方因素拟行试管婴儿、精液常规检查正常的生育力正常男性作为对照。以上病例经知情同意后采集外周血2ml，EDTA抗凝，使用QIAGENBioRobotEZ1全自动核酸提取工作站磁珠法抽提DNA，-20℃冰箱保存。　　二、实验方法　　1、使用Real-timePCR技术通过CyclingProbe法检测基因组DNA标本CFTR基因外显子10上M470V多态性分布情况，比较生育力正常男性、先天性双侧输精管缺如患者以及非梗阻性无精子症患者3组之间M470V基因型及等位基因的差异。　　2、参考网站NCBIprime-blast，应用软件Primer5.0自行设计引物，对CFTR基因内含子8的目的基因片段进行扩增、测序，从DNA测序结果直接分析TG-repeats、ploy-T多态性分布情况，比较生育力正常男性和先天性双侧输精管缺如患者之间TG-repeats、ploy-T多态性分布差异。并与此前论文一的M470V检测数据相结合，分析TG-repeats、ploy-T与M470V之间的关系。　　3、参考文献及网站NCBIprime-blast，应用软件Primer5.0自行设计CFTR基因全外显子扩增引物，对CFTR基因全外显子进行测序。测序结果使用Chromasv1.62软件分析并结合人工读图，参考http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/序列，在网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/在线比对，对新发现的突变位点在网站https://mutalyzer.nl/positionConverter在线分析。　　结果　　1、生育力正常男性、先天性双侧输精管缺如患者以及非梗阻性无精子症患者3组之间M470V基因型及等位基因分布的频率无显著性差异(P＞0.05)。MV基因型为最常见的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型频率为0.4296，其次为VV基因型，基因型频率为0.3704，最少见的为MM基因型，基因型频率为0.2。MM、MV、VV基因型在生育力正常的男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律(P＞0.05)。V470等位基因为生育力正常的男性中常见的等位基因，等位基因频率为0.5852，M470等位基因与V470等位基因在生育能力正常的男性人群中的分布比例约为0.7∶1。　　2、先天性双侧输精管缺如患者中T5等位基因的分布频率为0.3202，而生育力正常男性中为0.0340。生育力正常男性与先天性双侧输精管缺如患者T5等位基因的分布频率有统计学差异(P＜0.001)，T5与患者罹患先天性双侧输精管缺如有关。所有包含TG13T5单倍体基因型和TG12T5纯合体个体均表现为先天性双侧输精管缺如。TG12为生育力正常男性人群中最常见的等位基因频率。TG12T7为生育力正常男性中最常见的单倍体基因型。TG12T5-V470与患者罹患先天性双侧输精管缺如有关。　　3、对9例先天性双侧输精管缺如患者CFTR基因进行全外显子测序分析，在外显子区新发现4种不同于国外已知突变类型的新型突变，均为错义突变，并经网站http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/上报确认。　　结论　　1、CFTR基因M470V多态性分布本身与中国男性不育症患者罹患先天性双侧输精管缺如或非梗阻性无精子症无关。在生育力正常男性中M470与V470在生育力正常男性人群中分布比例约为0.7∶1，较欧洲人偏低。MM、MV、VV基因型在中国生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律。　　2、中国CFTR基因T5多态性改变与患者罹患先天性双侧输精管缺如有关。所有包含TG13T5单倍体基因型和TG12T5纯合体个体均表现为先天性双侧输精管缺如。TG13及TG12或与T5协同作用导致患者罹患先天性双侧输精管缺如。TG12T5-V470单倍体基因型可能与患者罹患CBAVD有关。　　3、中国先天性双侧输精管缺如患者CFTR基因外显子区存在突变，并且有着不同于国外已知突变类型的新型突变。