苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是可产生Bt杀虫晶体蛋白的一种革兰氏阳性菌,具有毒力高、对人畜与天敌安全、不污染环境的优点,已经广泛地应用于害虫防治中。随着Bt杀虫晶体蛋白对农业害虫的选择压力增强,其抗性问题逐渐引起了人们的高度重视。Bt杀虫晶体蛋白的杀虫机制一般认为有两种可能的机制：是中肠穿孔,二是信号传导导致细胞凋亡。两种机制都与Bt毒素受体蛋白密切相关。害虫中肠组织中与Bt杀虫晶体蛋白有互作的基因包括钙粘蛋白(Cadherin, CAD)、氨肽酶(Aminoopeptidase N, APN)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、糖脂转移酶(Glycosyltransferase, GT)等。其中,对碱性磷酸酶和糖脂转移酶的研究较少。本文以水稻重要害虫二化螟(Chilo suppressalis)为研究对象,克隆了二化螟Bt杀虫晶体蛋白的受体基因,扩增了部分基因的全长,并进行了RNA干扰分析。1、二化螟中定量PCR内参基因的筛选实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)能够快速地对多个样品进行基因表达分析,成为芯片和微点阵数据验证的常用手段。为了得到更精确的数据,通常需要一个和多个内参基因来对qRT-PCR数据进行归一化分析。本文检测了actinA1、GAPDH、 G3PDH、E2F、rp49等5个持家基因在二化螟不同龄期和不同组织中的稳定性,利用geNorm、NormFinder、stability index’assay和△Ct analysis选择其最佳内参。结果表明：在二化螟中最稳定的基因是actinA1;不同组织中,rp49和actinA1最适合同时作为内参；不同龄期发育中,G3PDH和E2F最适合同时作为内参。该结果为二化螟基因表达分析时内参基因的选择提供了参考。2、二化螟Bt杀虫晶体蛋白的受体相关基因全长克隆克隆得到二化螟中Bt杀虫晶体蛋白4类受体基因的全长序列,包括1个钙粘蛋白、3个氨肽酶、3个碱性磷酸酯酶和4个糖脂转移酶基因。此外,还获得了14个5’UTR序列和16个3’UTR序列。对已获得全长序列的基因做了进化关系分析。结果表明,CAD1与鳞翅目的家蚕、小菜蛾的钙粘蛋白在进化距离上相近,CAD2与双翅目的果蝇钙粘蛋白相近；其他一些基因均与鳞翅目部分昆虫的类似基因进化距离较近。3、二化螟Bt杀虫晶体蛋白的受体基因在不同龄期中肠组织中表达分析分析二化螟中4类Bt杀虫晶体蛋白受体基因的表达量变化,对于基因的功能研究具有重要意义。研究了Bt杀虫晶体蛋白的受体基因在二龄、三龄、四龄、五龄、六龄幼虫,成虫等不同发育阶段中肠组织中的表达量变化。结果表明,成虫中肠中所有4类受体基因均低表达。两个钙粘蛋白和两个碱性磷酸酶在不同发育阶段的表达量变化趋势一致,由二龄幼虫到老熟幼虫期间的表达量持续升高,成虫期降至与二龄幼虫相似的表达量。三个氨肽酶基因在幼虫期的表达量变化不大,到成虫期急剧下降至幼虫期的百分之一以下。三个糖脂转移酶之间有一定差异,其中GT3在中肠组织中表达量基本一致,但是GT1和GT2成虫中表达量均低于其他龄期。4、钙粘蛋白在二化螟不同组织中的表达分析及其RNA干扰利用定量PCR技术分析了两个钙粘蛋白在中肠、头、脂肪体、表皮等组织中的表达量差异。CAD1在中肠中的表达量显著高于其他组织,是头部的2000倍；CAD2在不同组织中的表达量差异不显著。合成了两个钙粘蛋白的siRNA,通过喂食法进行RNA干扰。利用定量PCR技术检测了干扰不同时间后靶标基因mRNA的丰度变化。结果表明,5天后两个基因表达量降低40%左右,7天后基因表达水平回升。CAD1和CAD2基因被干扰后,二化螟在转Bt基因水稻上的存活率明显上升,表明CAD基因的表达水平降低可能导致Bt抗性的形成。实验成功地实现了二化螟钙粘蛋白基因的沉默,为利用RNAi技术分析二化螟基因功能以及Bt抗性研究提供了参考。