论文部分内容阅读
结核病Mycobacterium tuberculosis,尤其是耐药结核病,仍然严重威胁着人类健康。2012年全耐药结核病(totally drug-resistant tuberculosis, TDR-TB)病例在印度的报道,更凸显结核病耐药机制研究的紧迫性。敏感性结核病转化为耐药结核后,药物选择更少,疗效更差,治疗时间至少延长4倍,治疗费用数倍增加,细致研究耐药机理与新型免疫治疗手段是有望解决这一问题的两种途径。我们想从泛耐药结核分枝杆菌菌株(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的蛋白质组学中寻找线索。利用iTRAQ (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation,用于相对和绝对定量的等量异位标签技术)技术,我们在两株XDR-TB与敏感菌株的差异蛋白表达谱中寻找到了高表达蛋白wag31。该蛋白已被证明与菌体形态,肽聚糖合成密切相关。利用模式菌株耻垢分枝杆菌M. smegma tis,我们构建了wag31高表达菌株,wag31低表达菌株,验证了过往研究中的结论,wag31过表达会造成膨大细胞,细胞裂解,发现了wag31低表达会造成的菌体延长与细胞分裂不均等程度的降低。随后,我们对wag31低表达菌株与对照菌株检测药物敏感性发现,wag31低表达菌株对利福平,红霉素的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)下降为对照组的1/4,对氯法齐明,新生霉素的MIC下降将为对照组的1/2,菌体脂类通透性实验也证明,wag31低表达提高了菌体的脂类通透性。提示我们多种脂溶性药物的敏感性提高可能与菌体脂类通透性改变有关。我们知道分枝菌酸作为分枝杆菌细胞壁的主要成分,提供了主要脂类屏蔽作用。借由以上,我们进行了wag31的coIP实验,找到了一系列候选结合蛋白,其中有多个蛋白都参与分枝菌酸的合成通路,Rv3285 (AccA3), Rv3799c (AccD4), Rv3280 (AccD5), Rv2524c (fas), Rv1484 (inhA),还有若干ATP酶。随后,我们选择了已知参与分枝杆菌长链脂肪酸合成过程的Rv3285作为研究对象,构建过表达M. smegmatis菌株,发现该蛋白的过表达降低了菌体的脂类通透性,提高了对利福平新生霉素的耐药性,MIC均提高了两倍。我们认为,wag31通过调节菌体脂类通透性维持菌体耐药性,而且Rv3285参与到这种调控作用中。在免疫治疗方面,我们研究了wag31与Ag85a+wag31融合基因构建的DNA疫苗在小鼠模型上的保护效果。含有wag31的DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠外周血中表现出较高的CD4+与CD8+T淋巴细胞比例。分离小鼠的脾淋巴细胞培养再刺激,wag31与Ag85a均可以引起高水平的IFN-gamma分泌水平(Ag85a最高),同时IL-4分泌水平很低,维持在最低检出值左右,这说明了DNA疫苗联用wag31与Ag85a可以刺激T淋巴细胞成熟并提高IFN-gamma分泌水平,激活Th1型免疫反应,是一种有效的抗原组合,有潜力成为新的候选保护性疫苗与DNA治疗性疫苗。