粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimμlating Factot,G-CSF)能在体外选择性地刺激造血前体细胞分化为粒细胞集落,有特异性受体(G-CSFR)。临床上G-CSF一般用于各种原因引起的粒细胞减少症,以及对抗感染。近年来来自不同实验室的证据表明G-CSF应用于大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)区,可显著缩小梗塞灶体积,改善缺血症状1,2,3,4,提示其具有保护缺血脑组织的作用。研究发现G-CSF能通过多种机制保护脑组织,其中包括直接作用于脑组织的多种作用机制,如抗炎症、抗凋亡、促血管生成等。一方面,有研究表明MCAO模型大鼠梗塞区G-CSFmRNA表达水平显著高于非梗塞区6,提示脑内可能表达G-CSF;另一方面,免疫组化显示G-CSFR在脑内也存在广泛表达。因此我们认为,G-CSF可能是一种自分泌或者旁分泌的保护因子,它能在脑内产生,并直接作用于脑内细胞;也可能存在某些细胞因子,能刺激脑内细胞高表达G-CSF,从而产生由G-CSF介导的神经保护作用。由于G-CSF外周应用可刺激粒细胞集落的白细胞增殖,难以直接临床应用于中枢神经系统疾病的治疗,寻求能诱导CNS表达G-CSF的替代品是一条可行的路径。在本研究中,我们首先验证脑内是否存在G-CSF及其受体的表达,并研究何种细胞能表达G-CSF及其受体,检测其基础分泌水平,寻找能诱导分泌G-CSF并诱导神经元对损伤耐受的细胞因子,并确认这些细胞因子诱导神经元对损伤的耐受作用是否与其诱导G-CSF分泌相关。本研究的目的:1、确认脑内是否表达G-CSF及其受体,研究缺血脑组织不同区域内G-CSF及其受体的表达水平;2、研究CNS来源的细胞中哪些能够表达G-CSF及其受体;3、筛选能够诱导CNS来源细胞表达G-CSF的细胞因子;4、研究上述细胞因子是否能通过上调G-CSF表达诱导神经保护。　　 第一部分G-CSF及其受体在CNS及CNS来源细胞中的表达、分布　　 为观察脑组织G-CSF及其受体是否受缺血影响,制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,再灌注24小时后断头取脑组织匀浆提取RNA,RT-PCR法分别检测G-CSF及其G-CSFRmRNA的表达情况和缺血周边区、缺血灶的表达情况。为分别观察大鼠皮层神经元及星形胶质细胞是否表达G-CSF及其受体,于10cm直径培养皿内,原代培养大鼠皮层神经元(1×106cell/ml)至第7天;传代培养大鼠星形胶质细胞(2×105cell/ml)至第3天,抽提细胞总RNA。然后,RT-PCR法分别检测G-CSF及其受体的表达情况。以上实验至少重复两次以上。结果显示:1、G-CSF及其受体确实在脑内有表达,且均在缺血周边区表达上升;2、G-CSF及其受体在神经元及星形胶质细胞中均有表达。　　 第二部分脂多糖诱导神经元及星形胶质细胞表达G-CSF呈剂量及时间依赖的特征　　 为筛选能刺激神经元上调表达G-CSF的细胞因子,于10cm直径培养皿内,原代培养大鼠皮层神经元(1×106cell/m1)至第7天,分别给予PBS(作为对照组)、前裂腺素E(protastin E,PGE)Img/ml、促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)50ng/ml、白介素10(Interleukine10,IL-10)10ng/ml、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)1μg/ml、雌激素(Estrogen,EST)20ng/ml和地塞米松(Dexamethasone,DEX)Inmol/m1)对其进行刺激,RT-PCR检测G-CSF表达的变化情况。为了解LPS刺激的神经元G-CSF表达与刺激时间及剂量的关系,用不同浓度的LPS刺激神经元或星形胶质细胞,RT-PCR及ELISA检测G-CSF的表达情况;选用其中一个有效刺激浓度,LPS刺激神经元或星形胶质细胞后不同时间点,RT-PCR及ELISA检测G-CSF的表达情况。以上实验至少重复两次以上。结果显示:l、LPS、IL-10及DEX均能上调神经元G-CSFmRNA的表达:2、经LPS刺激后,神经元和星形胶质细胞的G-CSF表达在RNA水平及蛋白水平均上升,且呈剂量及时间依赖的特征。　　 第三部分LPS预刺激通过上调G-CSF表达诱导了神经元对NMDA损伤的耐受　　 于96孔板内,原代培养大鼠皮层神经元(1×106cell/ml)至第7天,加入300nmol/mlNMDA培养0、1、2、3、6小时,CCK-8法分别检测细胞生存率,以建立神经元的NMDA损伤模型;设立300nmol/mlNMDA损伤3小时组和0.1μg/mlLPS预处理24小时后加300nmol/mlNMDA损伤组,CCK-8法分别检测细胞生存率,以观察LPS预处理是否能诱导神经元对NMDA损伤的耐受;分组给予刺激如下:NMDA分别加0、0.1、1、10ng/mlG-CSF,共同培养3小时,CCK-8法检测细胞生存率,以观察G-CSF是否保护了NMDA损伤的神经元;将培养的神经元分组如下:300nmol/mlNMDA处理3小时、0.1μg/mlLPS预处理24小时加300nmol/mlNMDA损伤3小时、100μg/ml抗G-CSF抗体(Anti-G-CSFantibody,G-CSF-Ab)及0.1μg/mlLPS预处理24小时加300nmol/mlNMDA损伤3小时,CCK-8法及MTT法检测细胞生存率,以观察G-CSF-Ab是否影响了LPS诱导的神经元对损伤的耐受。以上实验至少重复两次以上。结果显示:1、NMDA损伤后1小时神经元即已出现活细胞数量的减少,随时间延长活细胞数量逐渐减少;2、LPS预刺激能诱导神经元对NMDA损伤的耐受;3、G-CSF能减轻NMDA对神经元的损伤;4、加入抗G-CSF抗体与LPS共同预处理神经元,则神经元不出现对NMDA损伤的耐受。　　 第四部分DEX预刺激通过上调G-CSF表达诱导了神经元对NMDA损伤的耐受　　 为了解DEX刺激的神经元G-CSF表达与刺激时间及剂量的关系,于10cm直径培养皿中原代培养大鼠皮层神经元至第7天,分组给予不同浓度DEX刺激24小时后,收集上清液,ELISA法检测上清液中G-CSF蛋白的含量;分组给予0.1nmol/mlDEX处理不同时间后,收集上清液,ELISA法检测上清液中G-CSF蛋白的含量。为观察0.1nmol/mlDEX刺激24小时是否能诱导神经元对NMDA损伤的耐受,于96孔板内,原代培养大鼠神经元(1×106cell/ml)至第7天,将培养的神经元分成给予NMDA损伤、DEX预处理加NMDA损伤、抗G-CSF抗体及DEX预处理加NMDA损伤等各组,CCK-8法及MTT法检测细胞生存率。结果显示:1、DEX刺激神经元表达的G-CSF呈剂量及时间相关性;2、DEX预刺激能诱导神经元对NMDA损伤的耐受,且抗G-CSF抗体可显著抑制DEX预处理诱导的神经元对NMDA损伤的耐受。　　 结论：　　 1.大鼠脑内存在G-CSF及其受体的表达;脑缺血能诱导缺血周边区脑组织内G-CSF及其受体的表达上调。　　 2.大鼠脑皮层来源的神经元及星形胶质细胞均能表达G-CSF及其受体。　　 3.LPS能上调神经元及星形胶质细胞的G-CSF表达。　　 4.LPS预处理通过上调G-CSF表达诱导了神经元对NMDA损伤的耐受。　　 5.DEX预处理通过上调G-CSF表达诱导了神经元对NMDA损伤的耐受。