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目的Np95/ICBP90-like RING finger protein(NIRF)是新近发现的一种核蛋白,其包括802个氨基酸残基,蛋白分子内部含有UBL(ubiquitin-like domain)、PHD、YDG/SRA和RING finger结构域。随着其研究的深入,NIRF功能已涉及细胞增殖调节、蛋白多聚泛素化降解、细胞癌变进程控制以及更多未知的领域。已有研究报道,NIRF能与Cdk2-cyclin E复合体和let-7a结合,过表达的NIRF能阻止细胞周期于G1期。另外NIRF还具有泛素化酶E3的作用,即泛素化和自我泛素化功能,表明NIRF介导重要的蛋白降解途径。p53是细胞内重要的抑癌基因,p53的功能活动被认为是细胞对细胞异常、损伤、压力的一种应激反应,通过启动自我修复程序抑制细胞分裂诱导其进入衰老程序,或启动细胞程序性死亡清除异变的细胞。已有研究报道NIRF能与p53相互作用, NIRF本身也是一个高度调节蛋白,在细胞正常的生理状态下发挥泛素化E3连接酶的作用结合p53并将其降解,但NIRF与p53结合的蛋白结合域目前尚不清楚。本文研究证明NIRF能与p53结合成复合体参与泛素化蛋白降解途径,并测定出NIRF与p53结合的区域,为下一步研究蛋白泛素化降解和肿瘤的治疗提供实验基础和依据。方法(1)采用DMEM培养基培养HEK293细胞。培养基中补充含10%小牛血清和双抗。(2) RIPA蛋白裂解液收集HEK293细胞总蛋白。(3)细胞转染按照转染试剂说明说进行,转染48小时之后收获细胞,细胞收获前10小时添加蛋白酶体抑制剂MG-132。(4)将NIRF突变体在细胞内全部表达。在HEK293细胞内,分别转染四个突变体质粒,同时转染pCMV-3×FLAG空质粒和pCMV-FLAG-NIRF全长质粒,作为阴阳性对照.细胞裂解液经Western印迹,anti-NIRF, anti-FLAG和anti-β-Actin抗体检测分析。(5)用免疫蛋白共沉淀技术和蛋白质印迹分析技术鉴定NIRF与p53结合的蛋白结合域。HEK293细胞分别同时转染p53和各突变体质粒,细胞裂解液经p53抗体IP纯化,产物经WB分析。NIRF全长能与p53稳定结合,同时转染NIRF全长质粒作为阳性对照。结果结果显示,所有的突变体都能在细胞中表达,并且两种抗体检测结果完全一致。在免疫共沉淀试验中,ΔUBL、ΔYDG/SRA和ΔRING缺失突变体蛋白依然能被p53沉淀出,而ΔPHD却未能被p53沉淀出。结论本研究表明,NIRF通过PHD区域与p53形成复合体.该复合体可能参与蛋白分选、蛋白降解、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的细胞活动,从而形成与细胞增殖相关的新的信号通路,在肿瘤的发生发展中可能发挥着某种程度上作用。