心肌收缩功能在维持血流动力学、组织灌流中起着主要作用。失血性休克时,因有效循环血量降低,直接引起低血压,导致胃肠道的缺血缺氧,细菌及内毒素等有害物质经过肠淋巴系统进入血液,通过多种途径参与心肌的损伤,最终导致心肌功能障碍。因此,休克救治的关键环节是如何改善心肌收缩功能障碍,恢复心泵功能。可见,深入探索休克后心肌收缩功能障碍的发生机制,对于寻找心肌干预措施、防治重症休克及其导致的多器官功能障碍具有重要的临床意义。ω3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)作为一种营养素以及细胞膜成分之一,除了参与脂类介质合成外,还参与了炎症因子的生成与释放过程,进而调控炎症反应,影响某些免疫细胞的功能,同样还发挥着改善肠屏障功能的作用。细胞自噬在各种生命活动中,具有重要病理生理意义,参与了多种疾病的发生与发展;同样,细胞自噬在失血性休克后器官损伤的发病学中具有一定的作用。但是,ω-3PUFAs是否能改善失血性休克后的心肌收缩功能,其作用机制是否与细胞自噬有关?未见报道。为此,本实验在观察ω-3PUFAs对失血性休克大鼠存活时间与生存率作用的基础上,进一步探究ω-3PUFAs及自噬工具药对失血性休克大鼠心肌组织损伤、收缩功能、细胞自噬的作用,并从肠损伤角度探讨其相关机制,以期为防治失血性休克引起的心肌收缩功能障碍提供一定的实验资料。首先,建立失血性休克大鼠模型。将健康雄性大鼠放入美国MATRX动物麻醉机的塑料盒中吸入3%异氟烷诱导麻醉,氧流量控制在1~1.5 L/min,1~3 min进入手术需要的麻醉状态,将大鼠仰卧位固定于手术台上并连接大鼠专用无创氧气面罩,转入1.5%异氟烷维持麻醉状态。然后,实施双侧股动脉及单侧股静脉插管,备放血及肝素抗凝。手术结束后,稳定30 min,大鼠在清醒状态下,10 min内匀速放出大鼠全身血量的40%、维持低血压1 h后进行液体复苏,建立清醒失血性休克大鼠模型。将12只健康雄性大鼠分成两个组,分别是休克组(shock)、Shock+ω-3PuFAs组,观察ω-3PuFAs对失血性休克大鼠存活时间与存活率的作用;结果显示,Shock组的6只大鼠在30 h内死亡,Shock+ω-3PuFAs治疗组3只大鼠的存活时间均超过了50 h,其余3只在30h内死亡。研究结果提示ω-3PuFAs对失血性休克具有良好的干预作用。为进一步验证ω-3PUFAs对失血性休克大鼠心肌收缩功能的作用,取12只健康大鼠常规方法建立失血性休克模型,液体复苏后行肠淋巴管插管,留取休克肠淋巴液(PHSML),用于后续的实验研究;然后将48只大鼠随机分为8组:假手术组(Sham)、Sham+ω-3PuFAs组、Shock组、Shock+ω-3PuFAs组、Shock+PHSML+ω-3PuFAs组、Shock+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、Shock+ω-3PUFAs+雷帕霉素(RAPA)组,Shock+ω-3PUFAs+3-MA+PHSML组,每组6只。其中,Shock组、Shock+ω-3PuFAs组、Shock+PHSML+ω-3PuFAs组、Shock+3-MA组、Shock+ω-3PUFAs+RAPA组、Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA组按前述方法建立清醒失血性休克模型,维持低血压60 min后行液体复苏:Shock组输入放出全血加等量复方氯化钠液;Shock+ω-3Pu FAs组输入放出全血加含有ω-3PuFAs(0.2 g/kg)等量复方氯化钠液;Shock+ω-3PuFAs+PHSML组输入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2g/kg)、PHSML(1 ml/kg)等量复方氯化钠液;Shock+RAPA+ω-3PUFAs组在输入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2 g/kg)等量复方氯化钠液的同时,腹腔注射RAPA(10 mg/kg);Shock+ω-3PUFAs+PHSML+3-MA组输入放出全血及含有ω-3PuFAs(0.2 g/kg)、3-MA(30 mg/kg)、PHSML(1 ml/kg)等量复方氯化钠液;Shock+3-MA组输入放出全血及包含3-MA(30 mg/kg)的等量复方氯化钠液。Sham组、Sham+ω-3PuFAs组大鼠实施与休克组同样手术、但不放血;在与Shock组进行液体复苏相同的时间内,Sham组静脉输入等血量复方氯化钠液、Sham+ω-3PuFAs组静脉输入含有ω-3Pu FAs(0.2 g/kg)的等量复方氯化钠液。在液体复苏结束后3 h或相应时间点,行胸、腹部手术,经腹主动脉穿刺留取全血标本,制备血浆,用于检测生化指标;然后,快速剪下心脏测定离体心脏收缩功能,待离体心脏灌流之后留取心室一部分置于4%的多聚甲醛中,用于观察组织形态学以及应用免疫组织化学染色方法检测细胞自噬标志物微管相关蛋白轻链3(LC3 II)表达,其它心脏组织冻存于低温冰箱中;同时,留取肠组织(回盲部10 cm),取2 cm测肠湿重,烤干后测干重,计算湿/干比,取2 cm肠固定于4%多聚甲醛中,用于组织形态学观察。研究结果表明,失血性休克大鼠血浆CK-MB、LDH-L活性均显著高于Sham与Sham+ω-3 PUFAs组;ω-3 PUFAs治疗降低了失血性休克大鼠血浆CK-MB、LDH-L活性,3-MA治疗对二者无明显作用;静脉输入休克肠淋巴液废除了ω-3 PUFAs降低失血性休克大鼠血浆CK-MB、LDH-L活性的作用;RAPA抑制了ω-3 PUFAs降低失血性休克大鼠血浆CK-MB、LDH-L活性的作用;3-MA治疗却进一步提高了静脉输入休克肠淋巴液对提高大鼠血浆CK-MB的负性作用。此外,失血性休克引起了大鼠心肌组织肌丝断裂、水肿,增加了LC3-II表达;ω-3 PUFAs及3-MA治疗可明显改善心肌细胞损伤,降低LC3-II表达;静脉输入PHSML及RAPA治疗均抑制了ω-3 PUFAs的有利作用;3-MA治疗对静脉输入PHSML有一定的抑制作用。离体心脏功能结果显示,失血性休克大鼠离体心脏的±dP/dt max以及LVSP均显著低于Sham与Sham+ω-3 PUFAs组,HR与LVEDP未见统计学差异;ω-3 PUFAs治疗提高了失血性休克大鼠离体心脏的±d P/dt max以及LVSP;此外,静脉输入休克肠淋巴液废除了ω-3PUFAs对失血性休克大鼠离体心脏的有利作用,表现在显著降低了±d P/dt max以及LVSP水平。自噬特异性抑制剂3-MA提高了失血性休克大鼠离体心脏的±dP/dt max以及LVSP,对HR与LVEDP无明显作用;自噬激活剂RAPA对失血性休克大鼠经ω-3 PUFAs治疗后离体心脏的±dP/dt max、LVSP、HR与LVEDP均无明显作用;3-MA治疗进一步抑制了静脉输入休克肠淋巴液对大鼠离体心脏的负性作用,表现在显著提高±dP/dt max以及LVSP、降低LVEDP水平。针对肠损伤研究的指标显示,失血性休克大鼠肠组织评分、湿干比值均显著高于Sham与Sham+ω-3 PUFAs组;ω-3 PUFAs与3-MA治疗降低了失血性休克大鼠肠组织评分、湿干比值;静脉输入PHSML废除了ω-3 PUFAs降低失血性休克大鼠肠组织评分、湿干比值的作用;3-MA治疗进一步抑制了静脉输入PHSML对提高大鼠肠组织评分、湿干比值的负性作用。同时,失血性休克大鼠血浆D-LA、I-FABP水平均显著高于Sham与Sham+ω-3 PUFAs组;ω-3 PUFAs与3-MA治疗降低了失血性休克大鼠血浆D-LA、I-FABP水平;静脉输入休克肠淋巴液废除了ω-3 PUFAs降低失血性休克大鼠血浆D-LA水平的作用,对I-FABP无明显作用;3-MA治疗却进一步提高了静脉输入休克肠淋巴液对提高大鼠血浆D-LA、I-FABP的负性作用。上述研究表明,ω-3PUFAs提高失血性休克大鼠的存活时间,改善大鼠休克后心肌收缩功能,其作用机制可能与降低细胞自噬以及PHSML回流有关;同时,ω-3PUFAs也减轻了肠组织损伤,这可能是ω-3PUFAs减轻心肌损伤与功能障碍的又一机制。研究结果提示,ω-3PUFAs治疗可能成为防治重症失血性休克后心肌损伤的一个新措施。