论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的并发症之一,糖尿病患者一旦出现明显蛋白尿则病情通常难以逆转,往往发展至终末期肾功能衰竭,是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年来的研究发现,细胞自噬（Autophagy）在DN中扮演着重要的角色。自噬是细胞内一个基本过程,它将细胞内成分运输到溶酶体降解,维持着体内平衡和细胞完整性。正常情况下,细胞自噬功能处于基础水平,以维持细胞正常的生理功能。越来越多的研究表明,细胞自噬受损与糖尿病肾病之间密切相关,并参与了糖尿病肾病的发生与发展。在STZ诱导的早期糖尿病小鼠肾小管上皮细胞中,自噬标志物LC3-II和自噬溶酶体降解产物P62表达增多提示自噬活性可能减弱。硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin interacting protein,TXNIP）在细胞内普遍存在,高糖能够诱导TXNIP过表达,导致细胞发生氧化应激反应,引起细胞损伤和细胞外基质蛋白沉积,促进细胞凋亡。我们先前已有研究表明高糖诱导的系膜细胞TXNIP表达明显上调,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生增多,系膜细胞出现凋亡与表型转化。目前,有研究结果显示,糖尿病肾病患者的肾小管上皮细胞自噬活性减弱,自噬体累积过多,自噬标志蛋白LC3-II和溶酶体降解标记物P62表达增高;在肾小管上皮HK-2细胞中,敲低TXNIP后自噬活性明显增强,提示TXNIP与糖尿病肾小管细胞自噬损伤有关。但是,TXNIP在高糖诱导的肾小球系膜细胞自噬中的作用还未见报道。因此,本实验通过体外培养的小鼠系膜细胞（Mouse mesangial cells,MMCs）,研究高糖条件下MMC细胞中TXNIP与自噬的关系并探索其相关分子机制。方法:p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA干扰质粒,使用Fu GENER6转染试剂将TXNIP siRNA质粒和空白质粒分别转染MMCs在37°C,5%CO2培养箱中,以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液培养细胞,并将实验细胞分组:（1）正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇对照组（5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）干预刺激2、6、12、24、48、72小时后收集细胞;（2）正常对照组（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇对照组（5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖组（30 mmol/L glucose,HG）、空白质粒对照组（30 mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo质粒,HG+V）、TXNIP siRNA敲低组（30 mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒,HG+T）、巴佛洛霉素组（5.5mmol/L glucose+50 nmol/L Bafilomycin A1,BA组）、硝基酪氨酸组（30mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA质粒+0.02 mg/ml Nitrotyrosine,HG+T+N）、雷帕霉素组（30 mmol/L glucose+1 ng/ml Rapamycin,HG+R）都在干预刺激24小时后收集细胞。采用Western blot检测TXNIP、LC3-II、P62、Nitrotyrosine和p-m TORC1蛋白表达;采用Real-time PCR检测TXNIP、LC3-II和P62 m RNA表达;倒置显微镜检测细胞形态学;透射电镜和共聚焦显微镜检测自噬体;流式细胞术和Mito SOX检测ROS。结果:1 高糖对系膜细胞自噬的影响。与正常对照组相比,经高糖诱导的系膜细胞中TXNIP、LC3-II和P62的表达随时间点呈波峰变化,且在24h时达到峰值;甘露醇对照组中系膜细胞中TXNIP、P62及LC3-II表达未见明显变化。2 系膜细胞的形态变化。倒置显微镜观察结果显示,正常对照组及甘露醇对照组中系膜细胞呈星多角形、不规则、贴壁生长;经高糖和巴佛洛霉素A1诱导的系膜细胞呈椭圆形、与瓶底的粘附性下降;而TXNIP敲低组的系膜细胞形态相比高糖组呈多角形、与瓶底粘附性增高。3 敲低TXNIP对高糖诱导系膜细胞自噬体的影响。透射电镜观察结果显示,与正常对照组相比,经高糖和巴佛洛霉素A1诱导的系膜细胞中检测到自噬体明显增多;而甘露醇对照组无明显改变;TXNIP敲低组相比于高糖组,自噬体明显减少。4 敲低TXNIP对高糖诱导的系膜细胞自噬相关蛋白表达的影响。与正常对照组相比,经高糖和巴佛洛霉素A1诱导之后,系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62和p-m TORC1表达显著增高;而甘露醇对照组系膜细胞自噬相关蛋白表达未见明显变化;TXNIP敲低组系膜细胞中的TXNIP、LC3-II、P62和p-m TORC1相比于高糖组表达明显减少。5 敲低TXNIP对高糖诱导的系膜细胞ROS的影响。与正常对照组相比,经高糖、巴佛洛霉素A1诱导之后,系膜细胞中的ROS产生增多;然而,相比于高糖组,TXNIP敲低组及硝酸酪氨酸组系膜细胞中ROS生成明显减少。6 雷帕霉素对高糖诱导的系膜细胞自噬的影响与正常对照组相比,经高糖诱导之后,系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-m TORC1和Nitrotyrosine表达增高;经雷帕霉素处理之后系膜细胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-m TORC1和Nitrotyrosine的表达明显减少。结论:1 HG可能抑制MMC细胞自噬活性。2 HG诱导MMC细胞中TXNIP过表达,系膜细胞自噬体增多。3 敲低TXNIP可能通过减少ROS产生,减少LC3-II、P62的表达,通过m TOR信号通路,使HG诱导的细胞自噬活性增加。