目的:研究阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者、不同年龄段AD模型小鼠及AD模型细胞中自噬流的变化以及与β淀粉样蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)的关系。方法:(1)人脑组织:从人脑组织库获得AD患者死亡后的人脑组织标本,以其他原因死亡人脑组织标本作对照,进行免疫荧光染色,观察自噬流的情况。(2)动物水平:通过电镜检测、免疫荧光、免疫印迹等方法观察AD模型小鼠自噬流的变化情况;通过形态学检测观察不同年龄段AD自噬流模型小鼠脑内自噬流的变化。(3)细胞水平:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)稳定表达瑞士突变型APP基因的细胞株(APPswe)以及用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞为AD细胞模型,通过免疫荧光、荧光定量PCR、免疫印迹等方法检测观察自噬流的变化。结果:(1)AD患者脑内微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)表达增加,但溶酶体关联膜蛋白1(Lysosomal-associated membrane protein 1,Lamp1)和组织蛋白 B(cathepsin B,CTSB)表达下降,自噬体和溶酶体共表达减少。(2)在APP/PS1双转基因小鼠脑内,在老年斑形成前未出现自噬体堆积,但随着老年斑的沉积,自噬体和自噬溶酶体堆积,并且溶酶体标志物CTSB和Lamp1蛋白水平显著降低。(3)在APP/PS1/LC3三重转基因小鼠脑内,自噬体的数量随小鼠年龄增长而增加,但自噬溶酶体没有相应增多。在容易形成老年斑的皮质和海马区,自噬体多而自噬溶酶体少;在不容易形成老年斑的白质区,自噬体少而自噬溶酶体多。(4)过表达APPswe后细胞中ATG5、ATG14、LC3、p62和Lamp1蛋白水平显著降低,外源性Aβ25-35上调自噬早期相关蛋白ATG5、ATG12、ATG16L、BECN1以及LC3的表达,降低自噬中晚期自噬标记物p62、ATG14、Lamp1 的水平。结论:AD患者和AD模型小鼠脑内自噬体大量堆积,溶酶体数量和功能下降。在容易形成老年斑的区域,自噬体与溶酶体融合受阻,在不容易形成老年斑的区域自噬流通畅。AD中自噬的激活主要由于Aβ的增加,而不是突变的APP基因的过表达。外源性Aβ的增加和内源性APPswe过表达均导致自噬体和溶酶体融合受阻,以及溶酶体功能下降。目的:探讨自噬相关基因 14(autophagy associated gene 14,ATG14)在AD患者、不同年龄段AD模型小鼠及AD模型细胞中的表达规律,ATG14对Aβ的影响及机制,以及对AD模型小鼠功能的影响。方法:(1)通过免疫荧光、实时荧光定量PCR、免疫印迹等方法检测AD患者死亡后的人脑组织标本、APP/PS1双转基因AD模型小鼠及SH-SY5Y-APPswe细胞与SH-SY5Y细胞+Aβ25-35两种AD模型细胞内ATG14的表达情况。(2)将SH-SY5Y-APPswe细胞分为空白组、空载组、ATG14过表达组和ATG14抑制组,分别进行空白对照处理,瞬时感染空载体腺病毒处理,瞬时感染ATG14腺病毒过表达ATG14或感染ATG14 siRNA腺病毒沉默ATG14。通过Western blot检测ATG14蛋白水平;透射电镜检测各组细胞自噬体和自噬溶酶体的数量变化;Western blot检测自噬标记物以及Aβ产生过程相关蛋白的表达。(3)向APP/PS1双转基因小鼠海马注射携带ATG14质粒的腺相关病毒,以注射生理盐水为对照组,30天后Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力;Western blot检测ATG14和其他自噬标记物,以及Aβ产生相关蛋白的表达;形态学染色观察皮质和海马区老年斑的变化。(4)将SH-SY5Y-APPswe细胞株分为空载组和ATG14过表达组,分别用自噬激动剂雷帕霉素或自噬抑制剂巴伐洛霉素、氯喹处理细胞,然后检测各组细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量变化。结果:(1)免疫荧光染色显示,与对照组比较,AD患者脑内ATG14的表达无显著差异;AD患者脑内在老年斑沉积区域的细胞内ATG14低表达,LC3大量堆积;没有老年斑沉积的区域ATG14高表达,ATG14与LC3大量共存。(2)与同窝野生型小鼠比较,3月龄APP/PS1 AD模型小鼠脑内ATG14的表达差异无统计学意义,而6月龄和10月龄APP/PS1 AD模型小鼠脑内ATG14的表达显著下调。(3)与APPWT细胞比较,APPswe细胞内ATG14下调。用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞后ATG14显著下调,并随着Aβ25-35浓度的增加,ATG14逐渐降低。(4)ATG14过表达后,APPswe细胞内LC3-Ⅱ/Ⅰ升高,p62相对表达量显著下调,APP、BACE1、PS1、Aβ均显著低于对照组细胞。ATG14沉默后,APPswe细胞内LC3-Ⅱ/Ⅰ 比值和p62的相对表达均增加,APP、BACE1、Aβ均显著升高,PS1无显著变化。(5)APP/PS1双转基因小鼠海马注射腺相关病毒过表达ATG14后,水迷宫实验检测5月龄APP/PS1双转基因小鼠学习记忆得到部分改善,脑内老年斑减少,APP、BACE1、PS1、Aβ蛋白表达均显著低于对照组小鼠,而过表达ATG14并没有降低9月龄APP/PS1双转基因小鼠脑内的Aβ。(6)与单独使用自噬激活剂比较,用RAPA联合过表达ATG14处理细胞后,自噬体数量减少,完全酸化的自噬溶酶体数量增加;将自噬抑制剂Baf-Al、CQ分别和过表达ATG14联合应用,与单独使用自噬抑制剂比较,细胞内的自噬体和自噬溶酶体均增加。(7)ATG14过表达上调自噬相关蛋白BECN1、ATG5、ATG12、ATG16L的表达以及溶酶体标志物Lamp1的水平,而Rab7及其效应分子RILP却表达下降。结论:ATG14在AD患者大脑老年斑沉积区域低表达,在没有老年斑沉积的区域ATG14高表达。外源性Aβ的增加和内源性APPswe的过度表达均导致ATG14下调。ATG14过表达显著减少APPswe细胞及APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ的累积,改善老年斑形成早期AD模型小鼠学习记忆,减少脑内老年斑沉积。但是对老年斑形成中晚期AD模型小鼠脑内Aβ的减少没有显著作用。ATG14与自噬激活剂联合应用比单独用自噬激活剂更能促进自噬流。但是当自噬体和溶酶体融合阻断或自噬溶酶体降解受阻严重的情况下,ATG14过表达也会导致更多的自噬体聚集。ATG14通过激活自噬,促进自噬体与溶酶体融合,增加溶酶体降解,从而减少Aβ的产生并增强Aβ的降解,可对早期AD发挥神经保护作用。目的:探讨丙戊酸钠(valproic acid,VPA)和雷帕霉素(rapamycin,RAPA)联合用药对AD模型小鼠的作用及机制。方法:(1)将APP/PS1双转基因小鼠分为VPA组、RAPA组、VPA联合RAPA组以及对照组。VPA组给予30mg/kg/d VPA腹腔注射,RAPA组采用1mg/kg/d RAPA灌胃给药,VPA联合RAPA组联合应用30mg/kg/d VPA腹腔注射和1mg/kg/d RAPA灌胃给药,对照组注射等量生理盐水,分别处理小鼠4周后,采用巴恩斯迷宫检测小鼠学习记忆能力;血常规和血生化检测评估药物的毒副作用;免疫组化和甲硫素染色观察皮质和海马内老年斑的变化。(2)以SH-SY5Y-APPswe细胞为AD模型细胞,离体检测VPA、RAPA对细胞增殖、微管蛋白以及自噬流的影响。(3)采用免疫荧光检测小鼠脑内自噬体、溶酶体的表达;Western blot检测自噬标记蛋白的表达以及机制。结果:(1)药物处理4周后,血常规和血生化检测显示:治疗组小鼠与对照组小鼠用药对血液、肝脏和肾脏系统的影响无显著差异。(2)巴恩斯迷宫结果显示:除联合用药组以外,VPA、RAPA单独用药组比对照组小鼠均表现出更好的学习记忆能力。(3)甲硫素染色结果显示,治疗组小鼠脑内均出现老年斑数量减少,体积缩小,以VPA组的效果最为显著,RAPA组次之,VPA联合RAPA组效果最差。(4)Western blot结果显示各治疗组APP蛋白、Aβ蛋白表达均下调,VPA组下调效果最显著;VPA、RAPA单独用药组Tau蛋白、PHF-1蛋白表达均显著下调,而VPA联合RAPA组小鼠Tau蛋白、PHF-1蛋白仅稍微降低。(5)与对照组相比,VPA组和RAPA组小鼠脑内的AKT、mTOR、p70S6K无显著变化,但磷酸化AKT、磷酸化mTOR和磷酸化p70s6K水平显著降低,且RAPA对AKT/mTOR/p70s6K通路的抑制作用强于VPA。(6)免疫荧光染色显示:VPA显著上调溶酶体酶CTSB的表达,LC3表达稍微升高,而RAPA显著升高LC3,但CTSB无显著变化。Western blot结果显示,与对照组比较,VPA组LC3升高,p62下降,溶酶体标志物Lamp1显著升高,而RAPA组LC3和p62均升高,但Lamp1的表达无显著变化。结论:VPA和RAPA单独用药均可以改善AD模型小鼠的学习记忆能力,减少老年斑沉积,降低Aβ的生成和磷酸化Tau蛋白的表达。但VPA和RAPA不能联合应用治疗AD。VPA和RAPA均可激活自噬,AKT/mTOR/p70s6K介导VPA和RAPA诱导的自噬。VPA可以促进自噬体与溶酶体融合,增加溶酶体的降解功能,减少自噬体堆积。RAPA激活自噬但不能增强溶酶体的降解功能。