【摘 要】
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咖啡因是茶和咖啡的主要成分之一,适量的咖啡因摄入对人体具有积极作用,然而咖啡因的过量摄入可引发多种疾病。目前,低咖啡因茶和咖啡的市场需求正在不断增加。此外,茶作为世界上消费最广泛的饮料之一,其生产加工过程产生大量茶渣废弃物,茶渣直接排放造成污染环境和资源浪费,作为堆肥原料再利用有望解决该问题。然而,茶渣中咖啡因的存在会抑制微生物生长,影响堆肥腐熟,降低其施用效果。因此,本研究通过自然筛选和基因工程
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咖啡因是茶和咖啡的主要成分之一,适量的咖啡因摄入对人体具有积极作用,然而咖啡因的过量摄入可引发多种疾病。目前,低咖啡因茶和咖啡的市场需求正在不断增加。此外,茶作为世界上消费最广泛的饮料之一,其生产加工过程产生大量茶渣废弃物,茶渣直接排放造成污染环境和资源浪费,作为堆肥原料再利用有望解决该问题。然而,茶渣中咖啡因的存在会抑制微生物生长,影响堆肥腐熟,降低其施用效果。因此,本研究通过自然筛选和基因工程技术选育获得咖啡因降解菌株,初步开发了低咖啡因茶和咖啡;并利用降解菌株降解茶渣中的咖啡因,建立了茶渣堆肥生产工艺。本研究筛选获得两株咖啡因降解菌,经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida2-18和简青霉Penicillium simplicissimum 4-17。P.putida是研究最广泛的咖啡因降解菌株,然而其产生腥臭味和内毒素,不适合生产脱咖啡因的茶和咖啡。以食品安全级的解淀粉芽胞杆菌Bacills amyloliquefaciens HZ-12为宿主菌,整合表达P.putida2-18咖啡因降解酶（N-脱甲基酶）基因ndm ABCDE,构建工程菌株HZ-12::ndm ABCDE。经培养基优化,HZ-12::ndm ABCDE对咖啡因的降解率达到53.7%,与野生菌HZ-12相比提高了42.6%。通过咖啡因代谢物分析,咖啡因经去甲基化形成可可碱、副黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤和黄嘌呤。较细菌而言,P.simplicissimum 4-17在固体发酵中对咖啡因的降解具有显著优势,与腐熟菌Bacillus tequilensis B4、Bacillus subtilis B26和Aspergillus niger M90一同接种至茶渣和菌渣混合物中,进行堆肥实验。设计3组处理,分别为不添加任何外源菌剂的空白组CK、只接种腐熟菌株的实验组T1和同时接种简青霉与腐熟菌株的实验组T2。在为期18 d的高温堆肥中,实验组T2的高温期持续8 d,其中6 d超过55°C,最高温达到64°C。T2的咖啡因降解率为76.1%,比空白组CK和实验组T1的咖啡因降解率分别高出71.1%和59.0%,实现了咖啡因的高效降解。随后,通过检测混合堆肥的物理化学参数包括温度、p H、湿度、有机质、总氮、碳氮比、总磷、总钾和种子发芽率,茶渣与菌渣的混合堆肥达到完全腐熟要求。微生物群落分析表明,3组不同处理的堆肥中,细菌多样性和丰度显著高于真菌,高温期微生物的多样性最低。但在3组不同处理中,微生物的多样性和丰度无显著差异。变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinomycetes、拟杆菌门Bacteroidetes和厚壁菌门Firmicutes是茶渣堆肥中主要细菌门。其中Actinomycetes和Firmicutes在高温期是主要菌门;真菌OTU17从属于简青霉,在处理组T2的相对含量最高;通过堆肥样品的微生物群落与堆肥环境因子（温度、p H、湿度、有机质、总氮、碳氮比、总磷、总钾）、种子发芽率的CCA及RDA分析,茶渣堆肥样品的微生物群落结构差异主要与茶渣堆肥所处的不同时期有关。温度参数对细菌群落的影响不显著（P＞0.05）,而真菌群落结构变化受温度影响较大（P＜0.05）,湿度、总氮、碳氮比和总钾对微生物群落变化影响显著（P＜0.05）。
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