目前，心脑血管疾病的发病率和死亡率均呈持续上升趋势。我国每年死于心脑血管病的患者人数高达350万。其中，由动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)导致的心脑血管疾病占有重要的位置。AS以血管内皮细胞损伤、脂类堆积、炎症反应、动脉壁瘢痕重建和血栓形成等为其主要病理学特征。血脂异常、糖尿病、高血压、肥胖、抽烟、代谢综合征等均与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关。研究表明，AS病理过程是在众多危险因素作用下血管内皮细胞发生损伤，继而发生的一系列炎症反应，血管内皮细胞的损伤是AS发生的始动因素和中心环节。目前临床上仅有如肝素等少数特异性靶向于内皮细胞保护作用的AS防治药物，因此，寻找靶向于血管内皮细胞保护作用的AS防治药物具有重要意义。此外，血管内皮细胞损伤、功能障碍时还会导致血小板活化，通过多种机制参与AS的进展，因此抗血小板治疗在抗动脉粥样硬化治疗中起着重要作用，研究表明氯吡格雷、普拉格雷除了明确的抗血栓作用外，也具有一定的抗炎、减缓AS进展的作用。军事医学科学院杨日芳副研究员在前期工作的基础上，采用双靶标药物设计思路、以抗血小板聚集药物噻吩并吡啶类化合物的功能基团四氢噻吩并吡啶取代具有内皮细胞保护作用的α-氨基苄基膦酸酯类化合物胺基部分，设计合成了新型噻吩并吡啶类化合物，以期获得具有自主知识产权的兼具抗血小板聚集及内皮细胞保护作用的双靶标药物，改善AS时内皮细胞功能障碍，抑制炎症反应，减缓AS的进展，并可通过抑制血栓形成，达到对AS及其并发症的预防、治疗作用。同时也期望通过对结构的改造，降低噻吩并吡啶类化合物及α-氨基苄基膦酸酯类化合物的副作用并改善其体内代谢过程。因此，本文工作的主要研究内容是筛选并获得兼具抗血小板聚集及内皮细胞保护作用的化合物，并对其体内代谢过程和作用机制进行初步研究。第一部分新型噻吩并吡啶类化合物抗血小板聚集作用筛选及体内代谢的初步研究目的：筛选出具有抗血小板聚集作用的新型噻吩并吡啶类化合物，并对其抗血栓作用及体内代谢进行初步研究。方法：用体外抗血小板聚集实验筛选获得具有抗血小板聚集作用的候选化合物，并对筛选得到的具有抗血小板聚集作用的2个不同结构类型的化合物——YX-TP03、YX-TP16进行体外抗血小板聚集时-效关系实验；对筛选得到的候选化合物进行离体抗血小板聚集实验，初步探索其体内代谢过程；筛选得到的候选化合物进行出血时间(bleeding time，BT)实验，评价其对BT的影响；建立角叉菜胶致小鼠尾动脉血栓模型，评价筛选得到的候选化合物抗血栓作用。结果：1.筛选并获得5个具有抗血小板聚集作用的候选化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16应用体外抗血小板聚集实验筛选、获得5个具有抗血小板聚集活性的新型噻吩并吡啶类化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16，同等剂量下5个化合物的抗血小板聚集作用均与阿司匹林相当，较氯吡格雷弱。2. YX-TP03及YX-TP16的体外抗血小板聚集效应存在时间相关性小鼠灌胃给药后2h，YX-TP03(15mg/kg)表现出抑制血小板聚集趋势，给药后4h产生抗血小板聚集活性，该作用在给药后8h达到最大；YX-TP16(15mg/kg)在给药后1h开始表现出抑制血小板聚集趋势，给药后2h产生抗血小板聚集活性，该作用在给药后8h达到最大。3. YX-TP10具有离体抗血小板聚集作用，YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP16则无此作用对筛选得到的5个候选化合物进行离体抗血小板聚集实验，结果显示：同氯吡格雷相似，化合物YX-TP03(300μM)、YX-TP07(300μM)、YX-TP08(300μM)、YX-TP16(300μM)均无离体抗血小板聚集作用，提示此4个化合物均为前药，须经体内代谢产生活性代谢产物发挥抗血小板聚集作用；化合物YX-TP10(300μM)与阿司匹林相似，可直接作用于离体血小板，产生抗血小板聚集作用。4. YX-TP03可延长小鼠BTYX-TP03(21mg/kg)可显著延长BT，YX-TP07(21mg/kg)、YX-TP10(21mg/kg)表现出一定的延长BT趋势，YX-TP08(21mg/kg)、YX-TP16(21mg/kg)对BT无影响。5. YX-TP03、YX-TP10具有一定的抗血栓作用YX-TP03(21mg/kg)、YX-TP10(21mg/kg)均可显著缩短角叉菜胶致小鼠尾动脉血栓的长度，提示YX-TP03及YX-TP10具有抗血栓的作用。同等剂量下，两者的抗血栓作用弱于氯吡格雷；与阿司匹林相比，血栓的发生率较后者高，但血栓长度较阿司匹林给药小鼠短。YX-TP03的抗血栓作用存在剂量依赖性，7mg/kg即可产生抗血栓作用，63mg/kg抗血栓活性最强，剂量继续增加时抗血栓作用消失。此外，角叉菜胶给予前1h或角叉菜胶注射后24h给予YX-TP03(21mg/kg)均具有抗血栓作用，角叉菜胶注射前24h给予YX-TP03(21mg/kg)无抗血栓作用，此结果与YX-TP03的体外抗血小板聚集时-效关系结果一致。结论：1.本研究共筛选获得5个具有抗血小板聚集作用的新型噻吩并吡啶类化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16。2. YX-TP03具有与阿司匹林相当的抗血小板聚集、延长BT、抗血栓作用。YX-TP03无离体抗血小板聚集作用，推测其为前药，需经体内代谢产生活性产物发挥作用。3．YX-TP10可直接作用于离体血小板发挥抗血小板聚集及抗血栓作用。第二部分新型噻吩并吡啶类化合物内皮细胞保护作用筛选及其机制的初步研究目的：筛选出具有内皮细胞保护作用的新型噻吩并吡啶类化合物，并对其机制进行初步研究。方法：建立高糖或氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)损伤模型，通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测细胞活力筛选出具有内皮保护作用的候选化合物；用筛选得到的3个候选化合物处理高糖或ox-LDL损伤的HUVEC，通过实时定量PCR方法检测HUVEC胞内细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、单核细胞趋化因子-1(monocytechemotactic protein-1，MCP-1) mRNA的表达，进一步明确其内皮细胞保护作用，并对其抗炎作用机制进行初步研究；筛选得到的3个候选化合物处理高糖或ox-LDL损伤的HUVEC，用荧光法一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒检测细胞上清一氧化氮水平，对化合物内皮细胞保护作用机制进行初步研究；筛选得到的3个候选化合物直接处理HUVEC，通过细胞活力试验对其促增殖作用进行研究。结果：1. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有抗高糖或ox-LDL导致的HUVEC损伤的作用葡萄糖(45mM)或ox-LDL (150μg/ml)可导致HUVEC细胞活力下降，造成EC损伤。应用两种细胞损伤模型，筛选、获得3个具有内皮细胞保护作用的新型噻吩并吡啶类化合物——YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13。2. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13均可抑制高糖或ox-LDL诱导的HUVEC胞内ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA表达的上调葡萄糖(45mM)或ox-LDL (100μg/ml)处理后，HUVEC胞内ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA的表达上调；YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均可抑制高糖或ox-LDL诱导的HUVEC胞内ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA表达的上调。其作用与抗氧化维生素C (Vitamin C，Vc)相当，且与Vc相比，此3个化合物下调内皮细胞内VCAM-1、MCP-1mRNA的作用更为显著。3. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13均可对抗高糖或ox-LDL抑制HUVEC释放NO的作用葡萄糖(45mM)或ox-LDL (75μg/ml)均可造成HUVEC NO释放的降低，YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均可抑制此二者诱导的HUVEC NO释放的降低。4. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有促EC增殖作用YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均具有促进基础状态HUVEC增殖的作用。结论：1. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有抗高糖或ox-LDL所致内皮细胞损伤的作用；基础状态下，此3化合物具有促内皮细胞增殖作用。2. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13可能通过调节胞内粘附分子及趋化因子表达而发挥其抗炎、抗AS作用。3. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13促HUVEC释放NO的作用可能是其发挥内皮保护作用的机制之一。综上所述，本研究工作的主要创新之处在于：具有自主知识产权的新型噻吩并吡啶类化合物YX-TP03兼具抗血小板聚集、延长BT、抗血栓及血管内皮细胞保护作用，故推测YX-TP03可能具有较好的AS的防治作用。化合物YX-TP10可直接作用于离体血小板，产生抗血小板聚集及抗血栓作用，且其潜在的代谢优越性可能使之成为新一代的有效的抗血小板治疗药。