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目的：EphBs受体及ephrinBs配体存在于成年的大脑及组织中,在各种病理过程、生理功能中具有重要作用。最近的研究发现,ephrinBs作为致敏物质,通过激活中枢ephrinBs/EphBs信号系统引起中枢敏感化和痛觉过敏,但是机制尚未明了。PI3K涉及众多生理功能和病理过程的调节。研究证明PI3K信号通路参与伤害性信息调制,介导伤害刺激引起的中枢敏感化,如介导NGF/TrkA和GDNF/Ret信号激活引起的中枢敏感化和痛觉过敏等。其他研究领域已有实验证实EphBs受体参与调节PI3K的激活。本研究目的是证明PI3K是否参与介导中枢脊髓ephrinBs/EphBs信号激活引起的痛行为。方法：①为观察鞘内注射ephrinBl-Fc是否引起时间和剂量依赖性的痛觉过敏,鞘内注射不同剂量的ephrinBl-Fc (0.02,0.1,0.5μg溶于10μl生理盐水中),注射后30min,1,2,4,8,24,48h检测热缩足反射潜伏期及机械缩足反射阈值；为观察鞘内注射ephrinBl-Fc是否引起剂量依赖性的脊髓背角神经元Fos蛋白表达,鞘内注射不同剂量的ephrinBl-Fc (0.02,0.1,0.5μg注射后2h,采用免疫组织化学方法检测脊髓背角神经元Fos蛋白表达。②为观察鞘内注射ephrinBl-Fc是否时间依赖性激活脊髓PI3K及其下游信号蛋白磷酸化AKT,鞘内注射ephrinB1-Fc0.5μg/10μl后分别于10min、30min、1h4h及8h时间点取注射部位脊髓,用蛋白电泳检测鞘内注射ephrinB1-Fc引起相应注射部位脊髓PI3K-p11Oy及p-AKT表达变化的时间相；为观察鞘内注射ephrinBl-Fc是否剂量依赖性激活脊髓PI3K及其下游信号蛋白磷酸化AKT,鞘内注射ephrinB1-Fc0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl,30min后,用蛋白电泳检测鞘内注射ephrinB1-Fc引起相应注射部位脊髓PI3K-p110γ及p-AKT表达变化；为观察鞘内注射ephrinBl-Fc引起AKT的激活是否通过PI3K介导,鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl预处理,30min后同一部位鞘内注射ephrinB14-Fc0.5μg/10μl,再30min后用蛋白电泳检测相应注射部位脊髓p-AKT表达变化。③为观察PI3K抑制剂对ephrinB1-Fc引起的痛行为的影响。鞘内注射ephrinB1-Fc0.5μg/10μl,前30min(预处理)或后30min(后处理)鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin0.016、0.08、0.4μg/10μl和LY2940020.2、1、5μg/10μl,检测预处理组最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h及48h和后处理组最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h的热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值；为观察PI3K抑制剂对ephrinB1-Fc引起的脊髓背角神经元Fos蛋白表达的影响,PI3K抑制剂wortmannin0.4μg/10μl和LY2940025μg/10μl预处理30min或后处理30min,检测最后一次注射后2h腰4、5脊髓背角神经元Fos蛋白的表达。④为观察EphB受体是否参与福尔马林引起的中枢PI3K的激活。在注射福尔马林(1%,10μl)前30分钟,鞘内注射EphB受体阻断剂EphBl-Fc (0.5μg),记录注射福尔马林后0～5min和15～30min的累积舔足时间和缩足反应次数,蛋白电泳检测福尔马林注射后30min脊髓PI3K和p-AKT表达,免疫组织化学方法检测2h后脊髓背角神经元Fos蛋白表达。⑤为观察EphB受体是否参与神经病理性疼痛引起的中枢PI3K的激活。EphB受体阻断剂EphBl-Fc (0.5在CCI模型建立前后鞘内给药3次(CCI前1h,后1d,3d)(预处理)或单次鞘内给药(CCI后5d)(后处理),检测多次给药组CCI模型建立后1d、3d、5d、7d和单次给药组CCI模型建立后1d、3d、5d(给药后0.5h、1h、2h、4h、8h)、6d、7d的热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值,蛋白电泳检测多次给药组CCI模型建立后5d和单次给药组给药后2h脊髓PI3K和p-AKT表达,免疫组织化学方法检测多次给药组CCI模型建立后5d和单次给药组给药后2h脊髓背角神经元Fos蛋白表达。⑥为观察PI3K在ephrinB1-Fc引起的注射部位脊髓ERK激活中的作用。PI3K抑制剂wortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl鞘内注射30min后(预处理)鞘内注射ephrinB1-Fc0.5μg/10μl,30min后使用蛋白电泳法检测相应注射部位脊髓p-ERK的表达。结果：①鞘内注射EphBs受体激动剂ephrinBl-Fc,小鼠的热缩足反射潜伏期及机械缩足反射阈值呈时间依赖性和剂量依赖性降低,30min即可检测到明显降低,2h达到最低值,降低过程至少持续到24h,48h后趋于正常；鞘内注射ephrinB1-Fc后相应注射部位脊髓背角神经元Fos蛋白表达呈剂量依赖性增加。②鞘内注射ephrinB1-Fc后相应注射部位脊髓PI3K-p110γ表达呈时间依赖性和剂量依赖性增加,10min即可检测到明显增加,30min达到最高峰,8h恢复基础水平；p-AKT表达呈时间依赖性和剂量依赖性增加,1h达到最高峰,持续至少8h; PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预处理能阻断ephrinB1-Fc引起的注射部位脊髓p-AKT表达的增加。③PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预处理或后处理能部分防止或逆转ephrinB1-Fc鞘内注射引起的热、机械痛觉过敏,并且随剂量的增加抑制程度增加；PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预处理或后处理能防止或逆转ephrinB1-Fc鞘内注射引起的脊髓背角Fos蛋白表达的增加。④Eph受体阻断剂EphBl-Fc预处理能够减少福尔马林引起的舔足时间,缩足反应次数及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表达。⑤Eph受体阻断剂EphBl-Fc预处理或后处理能够部分逆转神经病理性疼痛引起的热、机械痛觉过敏及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表达。⑥PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预处理防止ephrinB1-Fc鞘内注射引起的相应注射部位脊髓p-ERK表达增加,并且呈剂量依赖性抑制。结论：PI3K信号蛋白介导小鼠脊髓ephrinBs/EphBs信号激活引起的痛行为,其作用可能部分通过ERK介导。