论文部分内容阅读
内吞体是胞内运输过程中重要的中间载体，维系了多种内吞相关细胞器之间的物质交流。细胞中主要有三种类型的内吞体:早期、晚期和循环内吞体。早期内吞体作为中心，介导了两个不同方向的货物运输，即通过早期内吞体转化为循环内吞体将膜蛋白运输回收到细胞膜;或通过早期内吞体转化为晚期内吞体将货物运输到溶酶体降解。这三种内吞体上分别具有特征性的小GTP酶（Rab）和磷脂酰肌醇磷酸(PI)。早期内吞体在进行不同方向的运输时，需要膜上的Rab和PI的相应改变。目前，对于这些过程中Rab如何转换了解较多，而对于PI转化的机制以及它们对内吞体运输的影响却知之甚少。 PtdIns3P是早期内吞体上特征性的PI，其在晚期内吞体上含量极低。目前对于早、晚期内吞体PtdIns3P水平的调控机制尚不清楚。通过遗传筛选，我们在秀丽线虫中发现了两个重要的PtdIns3P调控因子，SORF-1和SORF-2。在它们的突变体中早期内吞体上PtdIns3P水平显著升高，导致内吞体的过度融合而使体积变大，同时延误早-晚期内吞体转化和内吞货物向溶酶体的运输。SORF-1/SORF-2和RAB转换基因平行发挥作用，抑制PtdIns3P的合成，从而使早-晚期内吞体转化得以顺利完成。进一步研究表明SORF-1和SORF-2形成蛋白质复合体，并通过与Ⅲ型PI3K复合体的BEC-1亚基结合，抑制PI3K复合体的激酶活性。我们的研究还发现，人类细胞中SORF-1和SORF-2的同源蛋白WDR91和WDR81也形成复合体，并与Beclin1互作而抑制Ⅲ型PI3K复合体活性。在HeLa细胞中，WDR81和WDR91缺失同样表现出依赖于Beclin1的早期内吞体体积增大及PtdIns3P含量升高，并导致表皮生长因子受体EGFR的降解障碍。这些结果揭示了在早-晚期内吞体转化过程中PtdIns3P受到精准调控的一种新机制。 早期内吞体一方面通过转化为晚期内吞体，介导溶酶体膜蛋白及部分水解酶的转运而促进溶酶体的生成。另一方面，早期内吞体可发生管状化，形成循环内吞体，介导膜蛋白的循环回收。目前，磷脂分子及其效应蛋白在内吞体循环和溶酶体生成中的作用尚不明晰。通过以sorf-1为背景的增强子筛选，我克隆了一个磷脂酰肌醇磷酸酶，PIPP-1。它的突变导致内吞体和溶酶体异常增大、内吞体循环障碍和溶酶体数目减少。PIPP-1突变显著影响肠道细胞中PtdIns3P、PtdIns(4，5)P2和PtdIns(3，4，5)P3的水平。PIPP-1是一个保守的内吞体和溶酶体膜蛋白，表达它在人类中的同源蛋白TMEM55A/TMEM55B可以恢复其突变体中内吞膜泡形态异常的表型。进一步研究发现，过表达RAB-5的GAP蛋白TBC-2可以抑制pipp-1突变体中的内吞体形态异常和循环障碍，而tbc-2突变不会增强pipp-1突变体的这些表型，表明TBC-2在PIPP-1下游起作用。此外，过表达PIPP-1增加了溶酶体的数目，而tbc-2突变则可以抑制这种表型。这些结果表明PIPP-1通过TBC-2调控了内吞膜泡形态、内吞体循环以及溶酶体的数目。 我们发现PIPP-1不仅参与内吞运输，而且对线虫胚胎期凋亡细胞的清除至关重要。线虫中凋亡细胞的清除是研究吞噬作用的重要平台。凋亡细胞被吞噬细胞吞入后形成吞噬体，吞噬体可与早、晚期内吞体融合并成熟，最后与溶酶体融合并将凋亡细胞降解。pipp-1突变不影响凋亡细胞的识别和吞噬体的形成，但是阻碍吞噬体的成熟和吞噬溶酶体的降解。有趣的是，在吞噬通路中PIPP-1平行于TBC-2起作用。我们发现pipp-1突变体中PtdIns3P和PtdIns(4，5)P2在吞噬体上累积，分别抑制了吞噬溶酶体的形成和凋亡细胞在吞噬溶酶体中降解。进一步研究表明，pipp-1突变体中凋亡细胞的降解障碍是由于溶酶体酶不能及时进入吞噬溶酶体导致。这些结果表明PIPP-1通过调节PtdIns3P和PtdIns(4，5)P2促进吞噬溶酶体的形成和降解。 综上所述，本论文发现了三个参与内吞体运输过程中磷脂酰肌醇磷酸调控的重要因子，SORF-1，SORF-2和PIPP-1，其中，PIPP-1还调控了吞噬小体的成熟。这三个因子在进化上都呈现出保守性，对它们的研究将深化对内吞运输和凋亡细胞清除的认识，以及了解与之相关疾病的发病机制。