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第一部分DKK1和β-catenin在人黑素瘤中的表达及意义目的研究DKK1和β-catenin在人原位恶性黑素瘤组织、淋巴结转移恶性黑素瘤组织、正常人表皮组织中的表达,探讨DKK1在恶性黑素瘤发生发展中的作用及其与经典Wnt信号通路的相关性。方法应用免疫组织化学方法检测DKK1和β-catenin在人原位恶性黑素瘤组织、淋巴结转移恶性黑素瘤组织和正常人表皮组织中的表达。结果(1) DKK1在恶性黑素瘤组织中的表达低于正常人表皮组织。(2) DKK1在淋巴结转移恶性黑素瘤组织中的表达低于原位恶性黑素瘤组织。(3)β-catenin在恶性黑素瘤组织中的表达高于正常人表皮组织。(4)β-catenin在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达高于原位恶性黑素瘤组织。结论(1) DKK1在正常人表皮中表达较高,而在恶性黑素瘤中的表达减少,从而推测DKK1在恶性黑素瘤的发生中起一定作用。(2) DKK1在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达低于原位恶性黑素瘤,从而推测DKK1与恶性黑素瘤恶性程度呈负相关。(3)β-catenin在恶性黑素瘤中表达较高,而在正常人表皮中的表达减少,推测DKK1可能通过调控β-catenin的表达,从而在恶性黑素瘤的发生中发挥作用。(4)β-catenin在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达高于原位恶性黑素瘤,从而推测β-catenin与恶性黑素瘤恶性程度呈正相关。第二部分Ad-DKK1重组腺病毒载体的构建目的构建高表达目的基因DKK1重组腺病毒质粒,转染包装细胞HEK293,得到高滴度的腺病毒感染液。方法通过同源重组的方法构建表达目的基因DKK1的腺病毒质粒,首先通过PCR的方法扩增含有接头的目的基因片断DKK1,定向克隆进入腺病毒穿梭质粒pAdtrack-TO4,再转入含有腺病毒骨架质粒Adeasy -1的感受态细菌BJ-Adeasy中,同源重组产生腺病毒质粒Ad-DKK1,最终进入包装细胞HEK293,经过乒乓交互感染收获高滴度病毒感染液。结果(1)重组质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切鉴定,DNA电泳,结果Ad-DKK1显示:4.5kb大小的条带,与预期结果吻合,说明重组腺病毒Ad-DKK1构建成功。(2)荧光显微镜下观察,Ad-DKK1腺病毒感染人黑素瘤细胞A375,大量细胞均可见绿色荧光。(3)通过乒乓交互感染,收获高滴度的Ad-DKK1病毒感染液。(4) RT-PCR检测DKK1 mRNA表达,感染了Ad-DKK1人黑素瘤细胞A375中DKK1 mRNA水平明显高于对照组(P<0. 05)。(5) Western-blot检测DKK1蛋白表达,感染了Ad-DKK1的人黑素瘤细胞A375中DKK1蛋白水平明显高于对照组(P<0. 05)。结论(1)经酶切和测序鉴定,成功构建了高表达DKK1的Ad-DKK1的同源重组腺病毒。(2)荧光显微镜下观察,稳定感染了Ad-DKK1腺病毒的A375可见大量绿色荧光。(3)运用RT-PCR和Western-blot实验,验证了感染Ad-DKK1同源重组腺病毒的A375中DKK1的表达明显增高。第三部分DKK1对人黑素瘤细胞生物学行为的影响目的差异表达DKK1后,研究其对A375细胞的增殖、侵袭和粘附能力的影响,并探讨在A375细胞中DKK1是否通过调节经典Wnt/β-catenin信号传导通路而发挥作用。方法(1)通过细胞计数、细胞平板克隆形成实验和MTT实验,观察差异表达DKK1后A375细胞的增殖能力的改变。(2)运用Transwell小室侵袭实验和划痕实验,观察差异表达DKK1后A375细胞的侵袭能力的改变。(3)运用肿瘤细胞与细胞外基质粘附实验,观察差异表达DKK1对A375细胞粘附能力的影响。(4)通过PCR方法观察差异表达DKK1后A375细胞中β-catenin表达的变化。结果(1)高表达DKK1的A375组,细胞计数、克隆形成率及MTT吸光度值均小于对照组(P<0.05),沉默DKK1的A375组细胞计数、克隆形成率及MTT吸光度值均大于对照组(P<0.05)。(2)高表达DKK1的A375细胞在Transwell小室侵袭实验中,穿膜细胞数为56±6个,比对照组明显减少(P<0.05),在划痕实验中,36小时后划痕间隙最宽;沉默DKK1的A375细胞在Transwell小室侵袭实验中,穿膜细胞数为148±14个,比对照组明显增多(P<0.05),在划痕实验中,36小时后划痕间隙最早消失。(3)高表达DKK1的A375细胞与细胞外基质的粘附能力较对照组下降(P<0.05),而沉默DKK1的A375细胞粘附能力较对照组增强(P<0.05)。(4)高表达DKK1的A375细胞中,β-catenin mRNA水平较对照组明显下降(P<0.05),在沉默DKK1的A375细胞中,β-catenin mRNA水平较对照组明显增高(P<0.05)。结论(1) DKK1能够抑制A375细胞增殖,而沉默DKK1可以促进A375细胞增殖。(2) DKK1抑制A375细胞侵袭和迁移,而沉默DKK1能促进A375细胞侵袭和迁移。(3) DKK1能抑制A375细胞粘附,而沉默DKK1能增强A375细胞粘附能力。(4)在A375细胞中,DKK1通过抑制经典Wnt信号通路中的β-catenin的表达,从而发挥其抑制作用。第四部分DKK1对人黑素瘤细胞裸鼠皮下种植瘤生长的影响目的研究差异表达A375细胞中DKK1后,对裸鼠皮下种植瘤生长的影响。方法将差异表达DKK1的A375细胞和对照组A375细胞分别接种到裸鼠背部皮下,定时测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。裸鼠处死后,完整剥离瘤体,称取瘤体重量,并将肿瘤固定于4%多聚甲醛,石蜡包埋,切片。切片用于免疫组织化学检测DKK1和β-catenin的表达水平。结果(1)高表达DKK1的A375组,肿瘤的体积、重量和生长速度明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)沉默DKK1的A375组,肿瘤的体积、重量和生长速度明显大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组化显示,高表达DKK1的A375组,DKK1的表达明显高于对照组,沉默DKK1的A375组,DKK1的表达显著低于对照组。(4)免疫组化显示,高表达DKK1的A375组,β-catenin蛋白的表达明显低于对照组,沉默DKK1的A375组,β-catenin蛋白的表达显著高于对照组。结论(1) DKK1能够抑制A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。(2)沉默DKK1的表达能促进A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。(3) DKK1通过调节Wnt信号通路下游β-catenin的表达,从而调节A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。