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终末期肝病(End-stage liver disease,ESLD)是一种临床常见重大疾病,主要包括急性肝衰竭和慢性肝硬化。肝移植是唯一治疗手段。然而,肝源短缺是面临的最大难题。生物组织工程为解决这一难题提供了新方向。介于去细胞化(Decellularization)/再细胞化(Recellularization)策略可以完整保留器官(肝)骨架,故亦成为当今重要生命器官如肝、胰、心、胆、肺、肾等再造首选技术。来源于正常肝脏去细胞支架(Na?ve decellularized liver scaffold,nDLS)缺乏相关活性物质,故优化支架材料包括nDLS是目前学术界尚待解决的问题。本研究采用再生去细胞肝脏活性支架材料解决这一问题。我们研究显示,采用再生肝脏去细胞支架(Regenerative decellularized liver scaffold,rDLS),使其拥有肝再生微环境,与nDLS相比,提高种子细胞存活、促进血流通畅和成(肝)器官潜能。1 rDLS“天然肝再生微环境”特性将正常动物肝切除30-55%体积右叶后,体内保留3-5天后,取出在体外用洗涤剂脱去细胞。与nDLS相比,其细胞外基质成分表达肝再生所需细胞因子。如:TNF-α等,故使rDLS具有“天然肝再生微环境”。2提高原代肝细胞存活效率将分离获取的原代肝细胞种植到rDLS上进行检测。发现rDLS中肝细胞存活率明显高于nDLS;表明rDLS支架相容性优于nDLS。3移植后促进供-受体血流畅通采用体内外血流功能评估模型和多普勒血流仪评价发现,rDLS促内皮细胞分化优于nDLS。表明rDLS“良好的血流功能重造能力”。4诱导干细胞成(肝)器官潜能将成体肝脏干细胞NG2~+HPCs种植到rDLS上,体外3D培养或移植到小鼠体内。(肝)器官形成能力优于nDLS。进一步研究发现,该能力与NG2~+HPCs多能性相关。总之,rDLS为生物组织工程提供了新的支架材料。慢性肝硬化是肝细胞受到持续性损伤而导致结缔组织增生引起的慢性进行性疾病。虽然外源干细胞治疗成为新思路,但对于慢性肝硬化中内源干细胞是否有活性目前尚无定论。据此,我们对内源性肝细胞在慢性肝硬化中的生存做了初步的相关研究。我们采用已建立的二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)喂饲诱导的C57BL/6小鼠慢性肝硬化模型,每周随机选取小鼠肝脏标本,通过特异性组织学染色方法进行病理学鉴定并从中分离培养干细胞。炎症活动度(Inflammatory activity grade,G)采用苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,H&E)观察,纤维化程度(Fibrosis stage,S)Masson三色染色观察。肝内源干细胞(NG2+HPCs)采用“Percoll-Plate-Wait”法分离培养。直至12周肿瘤出现。1病理分期分级根据2007年国际简化分级和分期系统(分炎性为G1-G4级,分纤维化为S1-S4期)对纤维化肝脏进行病理分期分级。结果显示第1周开始出现炎症,第3周出现纤维化,以后随周龄增加,G/S逐渐增加,第8周炎症达到G4级,第11周纤维化达到了S4期。2 G/S相关性根据国际病理分级分期标准,S1-S2期G/S呈正相关趋势,S3级以后无相关性。3慢性肝硬化内源干细胞与纤维化相关性根据内源干细胞培养结果显示,3-8周之间均有干细胞存活,第9-10周干细胞存活减弱,11周以后干细胞趋于死亡(此时纤维化在S3期)。即干细胞在S1-S2区间存活,S3-S4区间可能死亡或失去活性。