CAFs通过IL-6/STAT3通路促进卵巢癌细胞上皮间质转化及增强紫杉醇耐药性的研究

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背景及目的:上皮性卵巢癌在女性常见生殖道肿瘤中位居第三,死亡率却居首位。紫杉醇联合铂类为卵巢癌一线化疗方案。约20%的患者在初次化疗时即可出现耐药。一线化疗缓解后约80%的患者在2年内复发,且复发后容易产生耐药,导致化疗失败,5年生存率仅约30%-40%。如何抑制卵巢癌紫杉醇化疗耐药是改善晚期卵巢癌预后的至关重要的问题。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经、血管和多种炎性/免疫细胞组成的有利于肿瘤增殖及转移的炎性微环境。其中,成纤维细胞是肿瘤微环境中间质细胞的主要组成部分,也被称为肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。它是肿瘤间质中被活化的成纤维细胞,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),有肌纤维母细胞的特质。CAFs可以通过自分泌及旁分泌产生多种细胞因子,调节自身及癌细胞的生长。近期研究发现CAFs高表达炎性因子IL-6、COX-2和CXCL1,并可释放HIF-1 α作用于VEGF-A,调控无氧条件下肿瘤血管生成。此外有研究报道CAFs与头颈鳞癌细胞共培养,可上调癌细胞和CAFs中的表达,进而降低头颈鳞癌对西妥昔单抗治疗的敏感性。肿瘤相关脂肪细胞和CAFs可通过外泌体传递miR21,作用于卵巢癌细胞凋亡酶激活因子(APAF1),抑制凋亡并增强紫杉醇耐药性。这些研究提示CAFs可以调控肿瘤细胞对治疗的敏感性,有可能成为改善肿瘤治疗疗效及逆转耐药的靶点。白介素6(interleukin-6,IL-6)是一种重要的炎性因子,它和细胞膜上的细胞因子IL-6R结合后,可激活JAK2/STAT3通路和P13K/AKT等通路。JAK2/STAT3通路是一条从膜到核的信号转导通路,JAK2蛋白激酶活化后,催化STAT3蛋白磷酸化进入细胞核,进而调控EMT相关基因等基因表达。目前研究发现IL-6/JAK2/STAT3通路过表达可促进肿瘤细胞上皮性-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。近期 Nature 杂志上两项研究提出EMT与化疗耐药密切相关;其机制可能是EMT可诱导癌细胞增殖能力下调,抑制细胞凋亡,并增强耐药基因的表达。本文拟探讨:CAFs来源的IL-6通过JAK2/STAT3通路对卵巢癌细胞EMT及紫杉醇化疗敏感性的影响。研究可进一步阐明肿瘤微环境中CAFs对卵巢癌的发生发展的促进作用,期待为紫杉醇耐药患者的靶向治疗提供新的实验基础。方法:1、我们从卵巢癌新鲜组织中分离培养原代癌细胞、CAFs和正常成纤维细胞(normalfibroblasts,NFs),通过细胞爬片免疫荧光实验、组织免疫组化染色、RT-PCR及Elisa法,定位并验证IL-6在卵巢癌病人组织中的表达。2、取CAFs和NFs的上清液作用于OVCAR3细胞,检测其增殖及侵袭能力和EMT相关蛋白的表达,并检测磷酸化JAK2蛋白及STAT3蛋白的表达。3、分别采用JAK2/STAT3通路特异性抑制剂AG490和β-TGF抑制剂抑制癌细胞上皮间质转化后,检测癌细胞的上皮间质转化和紫杉醇作用后的凋亡变化。卵巢癌组织中IL-6表达与化疗敏感性的关系:入组2009.1.1至2014.6.30于山东省肿瘤防治研究院妇科行手术治疗的卵巢癌患者。入组标准:1)初治并经术后病理确诊的病例;2)Ⅱ-Ⅳ期中晚期患者,行卵巢癌细胞减灭术(手术方式为全子宫+双附件+大网膜+阑尾切除+盆腹腔肿物切除术);3)有详细的临床病理资料及随访资料;4)术前及术后接受紫杉醇联合卡铂或顺铂的联合化疗。随访:随访自确诊之日起,采用病历跟踪、电话随访结合患者返院门诊复查情况随访,并截止至2016-06-30。切片结果分析:阳性结果为细胞间质成纤维细胞胞质及胞核黄染。阳性结果为细胞间质成纤维细胞胞质及胞核黄染。两位观察者根据间质IL-6的表达来判定结果。评估5个视野,不考虑染色强度,计数阳性细胞的比例。IL-6表达分为两个等级:高表达组,至少50%间质成纤维细胞阳性;低表达组,间质细胞核阳性不足50%。统计分析:所有的统计分析均采用SPSS17.0软件进行。肿瘤间质中IL-6的表达与化疗后复发间隔的关系采用卡方检验。肿瘤间质中IL-6的表达及其他临床病例特点与化疗后复发间隔之间的关系采用一元线性回归及多元线性回归检测。结果:1、分离纯化CAFs和NFs后,行细胞爬片,应用免疫细胞化学的方法鉴定成纤维细胞标志Vimentin和CAFs活化标志α-SMA的表达。发现:CAFs和NFs均表达Vimentin,但是与CAFs中高表达的α-SMA相比,NFs中α-SMA几乎不表达。a,进一步检测CAFs和NFs中IL-6的表达,发现:表达活性标志α-SMA的CAFs细胞同样高表达IL-6,α-SMA和IL-6在CAFs细胞中共定位;相反的是,有微弱α-SMA表达的NFs,IL-6表达同样微弱。b,同样地,在卵巢上皮癌组织切的IHC染色中,同样发现IL-6主要表达于卵巢癌间质细胞中,与间质CAFs细胞中α-SMA的表达共定位。提示CAFs是卵巢癌组织中IL-6的主要来源。c,抽提细胞总RNA,RT-PCR检测目的基因的表达效果。发现:CAFs中IL-6mRNA的表达明显高于NFs、原代癌细胞及OVCAR3。d,应用Elisa的方法检测了 CAFs、NFs、原代癌细胞和OVCAR3细胞上清中IL-6的表达,发现:CAFs中IL-6的表达明显高于NFs、原代癌细胞及OVCAR3。提示CAFs是卵巢癌病人组织中IL-6表达的主要来源。2、取CAFs及NFs的上清液作用于OVCAR3细胞,a,CCk8增殖实验发现来源于CAFs的上清可以显著刺激OVCAR3细胞的增殖;b,同样地,CAFs上清处理后的OVCAR3细胞侵袭能力明显高于NFs上清处理组。但是,加入IL-6的抗体后,CAFs上清对OVCAR3细胞增殖和侵袭的促进作用明显减弱。提示:CAFs来源的IL-6可能是促进OVCAR3细胞增殖和侵袭的重要因子。我们进一步检测了 CAFs及NFs的上清处理后OVCAR3细胞的上皮间质转化标志蛋白,发现:CAFs上清处理后OVCAR3细胞间质性标志物N-Cadherin、Vimentin明显升高,而上皮性标志物E-caderin表达下调,提示了癌细胞上皮间质转化增强。而加入IL-6的抗体后,CAFs上清对OVCAR3细胞的上皮间质转化标志表达的调控作用明显减弱。NFs上清处理后OVCAR3细胞上皮间质转化标志无明显变化。提示CAFs来源的IL-6促进了 OVCAR3细胞的上皮间质转化转变。将CAFs及NFs的上清液作用于OVCAR3细胞,结果显示CAFs上清处理组OVCAR3细胞JAK2蛋白及STAT3蛋白的磷酸化水平明显高于NFs处理组,而加入IL-6抗体后JAK2及STAT3蛋白磷酸化水平下降。CAFs的上清液处理OVCAR3细胞,同时加入JAK2/STAT3信号通路特异性阻断剂AG490,STAT3蛋白的磷酸化受抑制,OVCAR3细胞的上皮性标志物表达明显升高,而间质性标志物表达下调。提示CAFs来源的IL-6可能通过JAK2/STAT3介导了 OVCAR3细胞的上皮间质转化转变。3、CAFs及NFs上清液孵育OVCAR3细胞24h后,加入紫杉醇诱导细胞凋亡,应用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,发现:CAFs上清处理后的OVCAR3细胞凋亡细胞减少;而加入IL-6中和抗体后,可以减弱紫杉醇的抵抗,促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。进一步应用WB检测OVCAR3细胞中凋亡相关蛋白的表达,发现:与NFs上清处理组相比,CAFs上清处理组促凋亡蛋白表达减弱,凋亡抑制蛋白表达增强。提示CAFs来源的IL-6参与了 OVCAR3细胞的紫杉醇抵抗。将上皮间质转化诱导因子β-TGF的抑制剂SB431542加入培养体系,发现CAFs上清培养的OVCAR3细胞上皮性标志物表达明显升高,而间质性标志物表达下调,而且在紫杉醇的作用下凋亡细胞的数量增多。提示CAFs来源的IL-6诱导的卵巢癌紫杉醇抵抗可能与细胞发生上皮间质转化有关。卡方检验及Fisher精确检验显示:卵巢癌间质中IL-6表达与病理类型(P=0.014)及CA125(P<0.001)密切相关,而与年龄、病理分级、FIGO分期、新辅助化疗和细胞减灭术满意度无相关(P>0.05)。共收集2009.1.1-2014.6.30于山东省肿瘤防治研究院妇科行手术治疗的卵巢癌患者255例。免疫组化染色显示:IL-6蛋白主要表达于间质,在耐药性卵巢癌中表达显著升高,与卵巢癌的紫杉醇化疗敏感性密切相关。按接受TP方案化疗方案6个月内有无复发分为化疗敏感组(n=160)及化疗耐药组(n=95)。并按间质中IL-6蛋白染色情况分为低表达组(n=176)及高表达组(n=79),显示:IL-6蛋白低表达组化疗敏感率为69.3%,高表达组化疗敏感率为48.1%,两者存在显著差异(P=0.01)。结论:CAFs中IL-6表达显著高于NFs及卵巢癌细胞,CAFs是卵巢癌肿瘤微环境中IL-6表达的主要来源;CAFs分泌的IL-6因子可促进卵巢癌癌细胞JAK2蛋白磷酸化及STAT3蛋白磷酸化加强,促进癌细胞增殖增强,并诱导卵巢癌细胞上皮间质转化,促进癌细胞侵袭能力增强;CAFs通过IL-6/STAT3信号通路诱导卵巢癌细胞上皮间质转化后,可能导致癌细胞凋亡抵抗,导致癌细胞紫杉醇化疗敏感性降低,可能作为紫杉醇耐药卵巢癌治疗的新靶点。
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