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目的:本研究采用TNBS/乙醇混合溶液灌肠方式复制SD大鼠溃疡性结肠炎模型,经四神丸混悬液灌胃治疗后,对四神丸治疗溃疡性结肠炎大鼠的疗效进行评价。进一步验证四神丸治疗实验性结肠炎大鼠有效性的同时,意在从调控Rho/ROCK信号通路的角度,探究四神丸治疗UC的作用机制。方法:1.动物分组、UC模型复制及药物治疗:SD大鼠按随机数字表法分为四组,分别为正常组(Normal)、模型组(TNBS)、四神丸组(TNBS+SSW)和美沙拉嗪组(TNBS+ASA),每组8只,并使用记号笔在大鼠尾巴根部给每各组大鼠编号。正常组给予0.8 ml生理盐水灌肠,除正常组,按照动物体重,将3mg/kg三硝基苯磺酸的量加入50%乙醇溶液补足到0.8 ml灌肠,并且每周固定时间再重复2次上述模型制作方式。从模型复制结束的第二天计算,各组灌胃7天,正常组及模型组分别给予2 ml生理盐水,治疗组给予5 g/kg四神丸混悬液,阳性对照组给予150 mg/kg美沙拉嗪肠溶片混悬液。给药一周后处死,分离结肠组织。2.四神丸治疗大鼠UC疗效评价:每天灌胃前称重,观察剩余鼠粮和水量、活跃度、精神状态和体征等情况。分离结肠,测量其重量和长度,计算其肠重指数,进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分。制作结肠组织石蜡切片和H&E染色,显微镜下观察各组结肠组织。3.Rho/ROCK信号、结肠黏膜屏障连接蛋白和细胞能量代谢相关蛋白分析:采用Western bloting方法,对Rho/ROCK信号(如:p-RhoA、ROCK 1、p-Rac)核心指标、与结肠黏膜屏障相关连接蛋白((紧密连接蛋白(claudin-5、Jam-1)、粘附连接(VE-cadherin))、能量代谢关键蛋白p AMPKα等进行检测分析,从调控Rho/ROCK信号角度,探索四神丸维持复发型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜屏障完整的作用机制。4.PTEN/PI3K/Akt通路蛋白分析:采用Western bloting方法,对PTEN/PI3K/Akt通路信号进行检测分析,探究四神丸是否能从多方面治疗TNBS诱导的实验性溃疡性结肠炎。5.实验数据分析:利用统计学分析方式,将数据导入SPSS 22.0软件,进行T检验,数据以Mean±SD形式表示,P<0.05为数据统计结果显著差异,以P<0.01为数据统计结果极显著差异。结果:1.一般情况表现:与正常组比较,模型组食欲明显下降,活动也随之减少,精神极度萎靡,体质明显减轻,毛发暗黄易脱落且参差不齐无光泽。大便溏稀不成型,严重者有便血情况,肛门周围污秽粘便;与模型组对比,四神丸组、美沙拉嗪组给药治疗后情况倾向治愈,食量增加,活跃好动,体质增重,除此,稀便和便血者有所好转。此结果提示四神丸对结肠炎大鼠临床体征的改善作用。2.大鼠结肠组织表现:与正常组比较,模型组结肠长度显著减小(P<0.01),结肠重量则明显增重(P<0.05),肉眼可见结肠腔内大量水肿和充血,多处大小不一的糜烂和溃疡;与模型组对比,四神丸组、美沙拉嗪组结肠长度显著增长(P<0.01),结肠组织重量显著减轻(P<0.05),结肠组织IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显下降(P<0.01或P<0.05)。提示四神丸对UC的水肿、充血、糜烂溃疡和炎症等状况有积极改善作用。3.Rho/ROCK信号及结肠黏膜屏障相关连接蛋白检测:采用Western blotting测结肠总蛋白得知,与正常组比较,模型组p Rho A和ROCK 1表达均显著升高,而p Rac表达显著降低,肠黏膜屏障相关蛋白Claudin 5、Jam 1、CX 43和VE-cad表达也显著升高(P<0.01);与模型组对比,四神丸组、美沙拉嗪组p Rho A和ROCK 1均显著下降,而p Rac显著上升,肠黏膜连接蛋白Claudin 5、Jam 1、CX 43和VE-cad表达也显著升高(P<0.01)。此结果提示四神丸可调节结肠炎大鼠结肠黏膜相关蛋白Claudin 5、Jam 1、CX 43和VE-cad的表达和Rho/ROCK信号。4.能量代谢关键蛋白的检测:采用Western blotting检测结肠组织蛋白可得,与正常组比较,模型组组p AMPKα表达显著降低(P<0.01);与模型组对比,四神丸组、美沙拉嗪组p AMPKα显著上升(P<0.01)。此结果提示四神丸可调节结肠炎大鼠结肠黏膜p AMPKα蛋白的表达。5.PTEN/PI3K/Akt信号通路检测:采用Western blotting检测结肠蛋白可得,与正常组比较,模型组PI3K和Akt均显著升高,而PTEN显著升高(P<0.01);与模型组组对比,四神丸组、美沙拉嗪组PI3K和Akt均显著下降,而PTEN显著上升(P<0.01)。此结果提示四神丸可影响实验性UC大鼠结肠组织PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白的表达。结论:1.四神丸有效治疗实验性溃疡性结肠炎。2.四神丸有效治疗实验性溃疡性结肠炎可能是通过抑制PI3K/Akt信号途径,最终调节Rho/ROCK信号达到维持结肠黏膜屏障完整性实现治疗实验性溃疡性结肠炎的。