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雌性动物卵巢发育与其繁殖性能密切相关,本课题组前期研究发现,能量水平影响母猪原始卵泡的激活,葡萄糖作为日粮能量的首要代谢底物,其对原始卵泡激活与发育的影响及调控机制尚不清楚。不同类型动物的细胞研究表明,葡萄糖饥饿引起能量应激激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)并通过调控Hippo和mTOR信号途径参与多种细胞过程。但葡萄糖能否通过以上途径影响原始卵泡激活未见报道。因此,本研究以小鼠卵巢为模型,首先建立卵巢体外培养体系,考察不同葡萄糖水平对体外原始卵泡激活的影响,在此基础上进一步探究葡萄糖影响体外和体内卵巢原始卵泡激活的信号途径。本研究包括以下三部分:试验一葡萄糖水平对体外培养卵巢原始卵泡激活的影响选择3日龄SPF级昆明小鼠,建立小鼠卵巢体外培养体系,考察0、5.6、25、50、75mM葡萄糖水平对体外培养卵巢原始卵泡激活的影响,以及对体外培养卵巢糖酵解途径代谢产物含量的影响。结果显示:1.以3d、5d小鼠卵巢作为对照,3d小鼠卵巢体外培养2d,卵巢组织结构仍然完整,部分原始卵泡开始激活,提示卵巢体外培养体系建立成功。2.与对照相比,体外培养卵巢添加不同水平葡萄糖原始卵泡比例降低(P<0.05),初级卵泡比例升高(P<0.05);25mM、50mM和75mM葡萄糖处理组间原始、初级、次级卵泡比例差异不显著(P>0.05);体外培养24h,25mM葡萄糖处理组次级卵泡比例高于5.6mM处理组(P<0.05);体外培养48h,25mM葡萄糖处理组原始卵泡比例低于5.6mM处理组(P<0.05),初级卵泡/原始卵泡高于5.6mM处理组(P<0.05)。3.与对照相比,各葡萄糖处理组卵巢总蛋白含量增加(P<0.05),不同葡萄糖水平间差异不显著(P>0.05);与对照相比,添加5.6mM、25mM和50mM葡萄糖卵巢增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达增加(P<0.05)。4.体外培养24h,75mM葡萄糖处理组培养液丙酮酸含量高于对照组、25mM和50mM葡萄糖处理组(P<0.05),各葡萄糖处理组培养液乳酸含量高于对照组(P<0.05),25mM和75mM葡萄糖处理组培养液乳酸含量高于5.6mM葡萄糖处理组(P<0.05);体外培养48h,各葡萄糖处理组培养液丙酮酸含量高于对照组(P<0.05),葡萄糖水平低于75mM处理组间培养液丙酮酸含量差异显著(P<0.05),各葡萄糖处理组培养液乳酸含量高于对照组(P<0.05),25mM、50 mM和75mM葡萄糖处理组培养液乳酸含量高于5.6mM葡萄糖处理组(P<0.05)。5.75mM葡萄糖处理组卵巢ATP含量高于对照组和其他葡萄糖处理组(P<0.05);50mM葡萄糖处理组卵巢己糖激酶(HK)活性高于对照组和其他葡萄糖处理组(P<0.05),75mM葡萄糖处理组卵巢HK活性高于25mM葡萄糖处理组(P<0.05);对照组不添加葡萄糖,磷酸果糖激酶(PFK)活性升高(P<0.05);5.6mM葡萄糖处理组丙酮酸激酶(PK)活性高于对照组和其他葡萄糖处理组(P<0.05),对照组PK活性高于75mM和25mM葡萄糖处理组(P<0.05),75mM和50mM葡萄糖处理组PK活性高于25mM葡萄糖处理组(P<0.05)。以上结果表明葡萄糖是原始卵泡激活的必需营养物质,25mM葡萄糖是本试验原始卵泡激活的最佳水平,糖酵解途径参与原始卵泡体外激活。试验二葡萄糖影响体外培养卵巢原始卵泡激活的作用机制试验一筛选出25mM为体外原始卵泡激活的最佳葡萄糖水平。进而在葡萄糖饥饿和最佳葡萄糖水平处理下,考察AMPK-Hippo-YAP和AMPK-mTOR途径蛋白表达。最后采用AMPK激活剂AICAR或抑制剂Compound C处理体外培养卵巢,考察激活或抑制AMPK对原始卵泡激活的影响,以及体外培养卵巢AMPK-Hippo-YAP和AMPK-mTOR信号途径的变化。结果显示:1.葡萄糖饥饿或25mM葡萄糖处理卵巢12、24h,p-AMPK/AMPK、p-YAP(Ser127)/YAP差异不显著(P>0.05);葡萄糖饥饿48h,p-AMPK/AMPK、p-MST/MST增加(P<0.05),p-LATS1/LATS1、p-YAP(Ser127)/YAP、p-YAP(Ser94)/YAP与25mM葡萄糖处理相比差异不显著(P>0.05);葡萄糖饥饿或25mM葡萄糖处理卵巢24、48h,p-mTOR/mTOR、p-S6/S6差异不显著(P>0.05)。2.采用1mM、2mM AMPK激活剂AICAR处理卵巢,1mM AICAR处理组卵巢原始卵泡比例高于对照组和2mM AICAR处理组(P<0.05);对照组卵巢初级卵泡比例、初级卵泡/原始卵泡高于1mM和2mM AICAR处理组(P<0.05);2mM AICAR处理组卵巢次级卵泡比例高于对照组和1mM AICAR处理组(P<0.05)。3.采用2mM AICAR处理卵巢4h,p-AMPK/AMPK增加(P<0.05),p-LATS1/LATS1增加(P<0.01),p-YAP(Ser127)/YAP降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),p-S6/S6降低(P<0.01)。4.采用10、100μM AMPK抑制剂Compound C处理卵巢,10μM Compound C处理组原始卵泡比例低于对照组和100μM Compound C处理组(P<0.05),初级卵泡比例、初级卵泡/原始卵泡高于对照组和100μM Compound C处理组(P<0.05),对照组初级卵泡比例高于100μM Compound C处理组(P<0.05)。5.采用20μM Compound C处理卵巢6h,p-AMPK/AMPK降低(P<0.01),p-LATS1/LATS1、p-YAP(Ser127)/YAP与对照相比差异不显著(P>0.05),p-mTOR/mTOR和p-S6/S6升高(P<0.05)。以上结果表明葡萄糖通过AMPK/mTOR信号途径影响体外培养卵巢原始卵泡激活。试验三葡萄糖对体内卵巢原始卵泡激活的影响在试验一和试验二体外研究基础上,进一步开展体内试验,以新生小鼠为研究对象,考察血液葡萄糖(血糖)变化对体内卵巢原始卵泡激活的影响及其作用机制。结果显示:1.新生4d雌鼠饥饿24h,血糖低于正常哺乳的新生雌鼠(P<0.01)。2.新生4d雌鼠饥饿24h,原始卵泡比例高于正常哺乳的新生雌鼠(P<0.01),初级卵泡比例、初级卵泡/原始卵泡低于正常哺乳的新生雌鼠(P<0.01)。3.新生4d雌鼠饥饿24h,卵巢p-AMPK/AMPK和p-YAP(Ser127)/YAP与正常哺乳的新生雌鼠相比差异不显著(P>0.05),p-mTOR/mTOR和p-S6/S6降低(P<0.01)。以上结果表明葡萄糖可通过mTOR信号途径影响体内卵巢原始卵泡激活。综上所述,本研究得出以下结论:1.葡萄糖是卵巢原始卵泡激活的必需营养物质,25mM葡萄糖是本试验原始卵泡体外激活的最佳水平,糖酵解途径参与原始卵泡体外激活。2.葡萄糖通过AMPK/mTOR信号途径影响原始卵泡激活。