论文部分内容阅读
肺癌是目前世界上几大高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一，肺癌患者疾病进入晚期，便发生了骨转移，骨转移的发生可引起剧烈疼痛、脊髓压迫、高钙血症、甚至病理性骨折等骨相关事件，是目前临床上降低肺癌患者生活质量和影响患者生存的重要因素。本实验室长期致力于肺癌骨转移的相关研究，并发现S100B、钙调神经磷酸酶等与肺癌骨转移密切相关的分子。然而，肺癌骨转移发生的分子机制远未阐明，只有继续深入探讨，才有助于寻找肺癌骨转移治疗的有效方法。新近的研究发现雌激素与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。我们通过免疫组织化学染色发现雌激素受体β在非小细胞肺癌骨转移的组织中的表达显著增高。因此，深入探讨雌激素在非小细胞肺癌骨转移发生中的作用及其分子机制，能够为针对雌激素在治疗非小细胞肺癌骨转移中的应用提供理论依据。目的：研究雌激素以及其受体拮抗剂ICI对非小细胞肺癌体外侵袭和体内骨转移发生中的作用；使用雌激素诱导非小细胞肺癌细胞A549，观察其形态以及上皮和间质标志物的变化，观察雌激素在诱导EMT中的作用；使用雌激素受体拮抗剂ICI阻止雌激素受体复合物，观察其对雌激素诱导的EMT以及肺癌骨转移的影响；构建EMT-转录因子ZEB-1下调的肺癌细胞系，研究ZEB-1在雌激素诱导EMT的发生和促进肺癌侵袭转移中的作用；以期较为系统的阐述雌激素在非小细胞肺癌骨转移中，并为针对雌激素治疗肺癌骨转移提供坚实的理论基础。方法：1.通过免疫组织化学、体外侵袭实验、ELISA检测骨相关分子的表达以及体内实验检测雌激素以及雌激素受体拮抗剂ICI对肺癌骨转移发生的作用；2.通过Western blot，RT-PCR以及细胞形态学观察雌激素及其受体拮抗剂ICI对EMT发生的影响。3.RT-PCR筛选出了雌激素促进肺癌细胞EMT发生的重要转录因子ZEB-1，构建了带GFP标签的ZEB-1-shRNA,慢病毒包装感染入肺癌细胞，通过Western blot、ELISA以及体内实验进行观察抑制ZEB-1的表达后，对雌激素诱导的EMT以及肺癌骨转移的影响。结果：1.与未发生骨转移的组织相比，发生骨转移的肺癌组织中的雌激素受体表达显著增高，且ERβ的表达的差异更为显著。提示雌激素与肺癌骨转移相关。细胞侵袭实验证实，雌激素可以促进肺癌细胞侵袭能力的增加，而雌激素受体拮抗剂ICI能够降低雌激素诱导的肺癌细胞的侵袭能力，体内实验证实，雌激素可以促进NOD-SCID鼠骨转移数目的增多，而ICI能够降低NOD-SCID鼠骨转移的发生。2.通过细胞的形态学观察发现，与未经处理的A549细胞相比，经雌激素处理A549细胞发生了明显的多边形向梭形的转变。Western Blot结果证实其通过促进间质Marker，抑制上皮Marker的表达从而促进肺癌细胞EMT的发生。（p<0.05）；而雌激素受体拮抗剂ICI能够逆转雌激素诱导的EMT的发生；3.利用RT-PCR筛选雌激素诱导下的肺癌细胞EMT-转录因子结果发现ZEB-1的表达显著上调，Western Blot结果证实雌激素可以促进ZEB-1的表达，而ICI能够抑制ZEB-1的表达。通过慢病毒包装，将带GFP标签的ZEB-1shRNA载体高效感染入A549细胞，通过细胞形态学观察显示；ZEB-shRNA能够恢复细胞原有形态，其通过抑制Fibronectin的表达，促进E-cadherin的表达从而逆转了EMT的发生4.通过ELISA和体内实验证实：抑制ZEB-1的表达后，能够显著降低骨相关分子PTHrP的表达，且能够降低NOD-SCID鼠体内骨转移发生的数目，有效地控制了骨转移的发生。结论：1.雌激素显著促进了非小细胞肺癌骨转移的发生；2.雌激素诱导非小细胞肺癌细胞EMT的发生，进而促进了非小细胞肺癌骨转移的发生，而雌激素受体拮抗剂ICI能够抑制雌激素诱导的EMT以及肺癌骨转移的发生；3.雌激素通过诱导EMT-转录因子ZEB-1的表达，促进EMT发生，进而促进肺癌骨转移；4.干涉ZEB-1的表达，能够有效的逆转雌激素诱导的EMT的发生，进而抑制了雌激素诱导的肺癌骨转移的发生。