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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一种急性、高度传播性的肠道疾病,该病由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起,以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水等为主要临床特征。PED于2010年起在中国再次爆发,该次流行主要以变异毒株的出现为特征,造成80%-100%的哺乳仔猪发病,50%-90%的仔猪死亡。后来该病于2013年5月在美国爆发,给养猪业带来了极大的经济损失。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原,给当前养猪业造成极大的经济损失,其靶细胞主要是单核巨噬细胞系统和树突状细胞,其感染后主要的临床组织病变为淋巴细胞减少和炎性细胞浸润,最终导致机体免疫功能抑制,从而继发感染其他细菌和病毒。本论文针对这两种猪的重要病原,主要研究内容如下：1.PEDV的流行病学调查通过对2011年2月至2011年10月间从华中、华东、华南、西南地区12个省份的57个猪场采的455份临床样品(包括粪便样品、小肠样品和乳汁样品),用RT-PCR检测方法检测,结果显示,有45个猪场的278份样品为PEDV阳性,猪场阳性率为78.95%,样品阳性率为61.11%,这些阳性样品包括253份粪便样品、20份小肠样品、5份乳汁样品,总样品阳性率为61.11%,表明PEDV在我国流行十分广泛,感染率相当高,同时本研究还从乳汁中检测到PEDV阳性,说明PEDV可能通过母乳垂直传播给哺乳仔猪。2.PEDV CHGDU株的分离与鉴定尽管PEDV的感染率很高,猪流行性腹泻病毒的分离仍然十分困难。本研究将采自广东省某猪场发病仔猪的小肠样品处理后,接种Vero-CCL81细胞,同时维持液中添加151μg/mL胰蛋白酶,盲传3代后,有一份小肠样品接种的细胞观察到明显的PEDV特征性的多核细胞体病变,分离到的病毒通过RT-PCR和IFA检测,证实PEDV阳性,将该分离株命名为CHGDU。3. PEDV CHGDU株S基因全长测定及分析通过对CHGDU毒株S基因全长测定及分析发现,该毒株与NCBI中登录的另一毒株GD-A毒株S基因的序列同源性为100%,进一步分析S基因的序列特征发现该毒株属于变异毒株,通过与疫苗株CV777 S蛋白相应区域分析结果表明：中和表位COE区域存在3个氨基酸突变(T554S、G599S和Q638S),而另一中和表位S1D区域包含5个氨基酸的突变(N724S、N728S、P768R、L769S 和 D771S),与CV777相比,CHGDU在S1/S2结合位(P768R)和S2’位点突变为精氨酸(G896R),这些位点可被蛋白质转化酶PC (proprotein convertase, PC)所识别和切割,从而增强病毒致细胞病变的能力和毒力。将CHGDU株的S基因与已测定的其他152株GenBank登录的S基因全长序列进行比较,并利用MEGA6软件绘制系统发育树,发现这些毒株可分为两个大群即Genogroup 1和Genogroup 2;其中这两个群又被分为两个亚群即1a、1b 及2a、2b。Genogroup1群主要由2010年以后分离和报道的中国毒株以及2013年和2014年美国流行毒株组成,其中CHGDU株属于1a群,属于PEDV变异株,该毒株与处于2b亚群的疫苗毒株DR13和CV777遗传关系较远。4.病毒的S基因全长克隆及重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP的拯救为进一步验证S基因在病毒致病过程中的作用,本研究首先克隆了CHGDU的S基因全长,成功构建表达载体PCAGGS-CHGDU-S-Flag,通过转染Vero-CCL81,IFA验证S基因能顺利表达,并在5μg/mL胰蛋白酶存在的条件下诱导细胞和细胞的融合,进一步将该基因克隆至穿梭载体, 成功构建穿梭载体PPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP,通过体外转录RNA,电转至含有鼠肝炎病毒S基因的重组病毒mPEDV感染的Vero-CCM细胞中,通过定向重组的方法拯救出重组病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP,并且验证该毒株在培养过程中需要外源添加胰蛋白酶,证明S基因是决定PEDV毒株对胰蛋白酶依赖的关键基因。5. Vero-hTMPRSS2-HA细胞系的构建与hTMPRSS2在病毒感染过程中作用的研究首先克隆了人丝氨酸蛋白酶TMPRSS2基因,构建了含有HA标签的表达质粒PQCXIN-hTMPRSS2-HA, Western-blot证实该蛋白正确表达,利用MLV系统,构建稳定表达细胞系Vero-hTMPRSS2-HA,并对细胞系进行了IFA和Western-blot检测hTMPRSS2的表达,证实稳定表达hTMPRSS2的细胞系构建成功,再利用含有GFP重组病毒为工具,测定了hTMPRSS2在病毒感染和释放过程中的作用,结果表明,hTMPRSS2在病毒入侵和释放过程中均没有明显的作用。6.猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究本研究采用WH株体外感染猪原代肺泡巨噬细胞,分别在感染后24小时和48小时取样进行全基因组表达谱分析,结果显示：24小时感染组中共有266个基因差异表达,其中包括212个上调表达和54个下调表达的差异基因；48小时感染组中共有175个基因差异表达,其中包括150个上调表达和25个下调表达的差异基因,但两组间相互比较,仅有6个基因差异表达。24小时感染组差异表达基因主要与细胞的运动、血液系统的形成和功能、免疫细胞运输、细胞-细胞间的信号传递和相互作用和肾脏相关疾病等功能相关,与之相关的生物学进程主要有：免疫反应、炎症应答、抗原递呈、趋化性和抗凋亡等；而48小时感染组差异基因主要与癌症、胃肠疾病、肿瘤的形成、细胞的死亡、组织损伤和免疫细胞的运输等功能相关,与之相关的生物学进程有：炎症应答、免疫反应、趋化性和细胞与细胞信号传递等。在两个感染时间点,均发现大量炎症相关基因的上调表达,炎症因子的上调表达可能PCV2导致系统性的炎症反应的原因。