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猪水肿病(Porcine Edema disease，ED)是仔猪常见的一种急性致死性传染病，主要由某些特定血清型产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli，SLTEC)引起的肠毒血症。以胃大弯、肠系膜及脑部水肿为特征，常伴有共济失调、麻痹或惊厥等神经症状，主要发生于断奶仔猪。采食量大、生长快、体况健壮的猪最为常见。发病率通常为10％～35％，病死率可高达90％。猪群水肿病血清抗体的检测对预防和控制该病的爆发具有十分重要的意义。类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是直接导致猪水肿病发生的主要毒力因子，其是由一分子A亚基和5分子的B亚基共同组成的聚合体。A亚基是该毒素的主要毒力亚单位，为毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用。B亚基没有毒性而具有免疫原性，是水肿病毒素的主要保护性抗原。本研究是针对SLT-Ⅱe的B亚基，初步建立一种特异、敏感、能对所有血清型猪水肿病大肠杆菌做出检测的血清学检测方法，为新型疫苗的研究奠定基础。 1．SLT-ⅡeB、SLT-Ⅱe3B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 参照国外报道的Escherichia coli S1191菌株(M21534)，设计了两对特异性引物，以本地分离的猪水肿病大肠杆菌鄂E(Ee)株基因组为模板，PCR扩增出去掉信号肽和跨膜区的类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基的序列，再利用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ将SLT-ⅡeB基因融和串联起来，筛选得到一个三拷贝SLT-ⅡeB基因。将单拷贝和三拷贝SLT-ⅡeB基因克隆到原核表达载体pGEX-KG，构建重组质粒pGEX-SLT-ⅡeB和pGEX-SLT-Ⅱe3B。序列测定证实，SLT-ⅡeB基因全长204bp，编码68个氨基酸，未发生任何碱基突变，与NCBI上所发表的12个SLT-ⅡeB序列：AY368993、AY332411、X81417、X81416、X81415、AJ567999、AJ567998、AJ298298、AJ249351、AB252836、M36727、M21534核苷酸同源性都是100％。SLT-Ⅱe3B基因全长630bp，编码210个氨基酸，与GenBank中M21534的序列同源性达到99.9％，只有第536处的点突变，由C变成T(C→T)，相应的氨基酸序列由脯氨酸突变为亮氨酸(P→L)。原核表达载体pGEX-SLT-ⅡeB、pGEX-SLT-Ⅱe3B转化E．coli BL21(DE3)，在IPTG诱导下获得表达，大小与预期结果相符。表达产物均以包涵体形式产生，通过提取包涵体——十二烷基肌氨酸钠变性——透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。Western blot检测证实表达蛋白与猪水肿病标准阳性血清反应，具有良好的免疫学活性。同时用表达产物免疫SPF昆明系小鼠能够诱导产生较高水平的抗体，为亚单位疫苗的研究奠定基础。 2．猪水肿病SLT-Ⅱe3B-ELISA诊断方法的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的GST-SLT-Ⅱe3B蛋白作为抗原，包被ELISA