论文部分内容阅读
胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors,简称IGFs)是一类与人类胰岛素结构和功能相似的多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。IGFs家族由两种多肽(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、两类特异性受体及六种结合蛋白组成。IGF-Ⅰ是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的一种活性蛋白多肽物质。研究表明,IGF-Ⅰ具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构功能、促生长、促细胞分化、创伤修复的功能。在骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病上具有预防和治疗的作用。IGFBP-3(Insulin-like growth factor binding protein 3)作为IGFBPs家族成员之一,可通过IGF-Ⅰ依赖及非IGF-Ⅰ依赖方式调节细胞增殖和凋亡。最近的研究发现IGFBP-3与肿瘤的发生发展密切相关,具有促凋亡、抑制细胞生长、增强癌细胞的放射敏感性等作用,IGFBP-3已成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。因此本研究通过农杆菌介导,将IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因导入水稻中,以期以水稻作为生物反应器大量生产该蛋白。
本研究以人源IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因序列为基础进行修饰,然后人工合成该基因。首先在其两端分别加上蛋白标签(FLAG),FLAG蛋白标签是一个与重组蛋白相融合的由8个亲水氨基酸组成的多肽片断,具有与特异性单抗结合的位点,以便以后对其蛋白提纯。其次加上内质网滞留序列(KDEL),可以避免其在植物细胞内的降解。最后加上过表达水稻种子贮藏蛋白基因Glu-2(Gt1),使IGF-Ⅰ和IGFBP-3基因可以在水稻种子中特异表达。将改造好的基因连接到构建好的植物表达超双元载体上,利用冻融法转入农杆菌菌株EHA105中,侵染水稻种子,经潮霉素筛选,最终获得再生植株。再生植株经潮霉素、PCR检测,获得了的转基因植株。再对其转基因植株的幼穗提取RNA进行RT-PCR分析,证明大多数植株均转录所需的目的基因IGF-Ⅰ和IGFBP-3,Western blot结果表明其表达蛋白具有胰岛素样生长因子原性。癌细胞凋亡实验证明,水稻中表达的IGFBP-3具有生物活性,对乳腺癌细胞和肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。为进一步研究IGF-Ⅰ和IGFBP-3的生理机制奠定了基础。