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功能性包涵体(active inclusion bodies,AIBs),与传统意义上的包涵体相比,其优点是易纯化、对宿主细胞毒性较小、无需经过变复性过程即可发挥生物活性,因此受到了广泛关注。虽然现在已发现多种蛋白质可形成功能性包涵体,但对功能性包涵体蛋白折叠机制的相关研究没有报道。绿色荧光蛋白(GFP)是一种可形成功能性包涵体的蛋白,其优点是可自发荧光且荧光的产生无需添加外源底物、荧光性质稳定,近年来通过氨基酸位点突变和相关蛋白质筛选过程,已获得了多种折叠性不同的绿色荧光蛋白,为功能性包涵体蛋白折叠机制的研究提供了条件。本文以四种折叠性不同的绿色荧光蛋白突变体Em GFP、Se GFP、cp GFP、sf GFP构建重组蛋白,分析比较四种GFP折叠突变体融合ELK16形成功能性包涵体的产量,探明蛋白的折叠性与功能性包涵体产量和活性的相关性,得到如下结果:1.纯化重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化Em GFP、Se GFP、cp GFP、sf GFP四种蛋白,SDS-PAGE检测一条主带,酶切除去标签,纯化目的蛋白。2.重组蛋白功能分析。紫外可见光光谱扫描显示485 nm具有最大吸收峰,荧光光谱扫描分析激发光峰值在485 nm,发射光峰值在510 nm。单位质量蛋白的荧光强度无明显差异,但在不同浓度的变性剂尿素和盐酸胍处理下荧光值有所下降,其中cp GFP下降趋势最为明显。3.功能性包涵体的表达。融合表达含有C端自聚集肽ELK16的GFP突变体,SDS-PAGE和蛋白印迹检测表明蛋白表达主要在不溶性沉淀中。激光共聚焦显微镜观察到功能性包涵体存在于细胞特定区域,傅里叶红外光谱分析表明功能性包涵体中GFP蛋白的β折叠具备完整性。4.包涵体的产量与荧光值分析。分别在28℃诱导12 h、37℃诱导4 h,破碎细胞获得不溶性包涵体,结果显示包涵体产量cp GFP>Em GFP>Se GFP>sf GFP,说明包涵体产量与折叠性成反比关系。分别在28℃诱导6、8、10、12 h,37℃诱导2、3、4、5 h,对重组细胞的荧光值变化进行分析,结果显示Em GFP荧光强度低于Se GFP,而cp GFP荧光强度也低于Se GFP,表明氨基酸残基突变和循环突变影响蛋白在包涵体中的折叠。综上所述,本研究利用四种GFP突变体研究它们指示功能性包涵体的性质,结果表明蛋白质的产量和活性在功能性包涵体不可兼得,这与已报道的蛋白可溶性表达和功能之间的关系一致,所以,获得理想的产量高和活性好的功能性包涵体依然面临挑战。此外,该系统潜在应用于筛选新的聚合标签以使蛋白高效形成功能性包涵体。