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背景单侧下肢短缩畸形是致残的原因之一,影响步态,导致负重关节退行性改变和脊柱侧凸畸形。决定骨延长新骨形成的关键因素是牵张应力的强度和手术截骨技术,在临床骨骼延长再生过程中,牵张应力在持续性的基础上,周期性加大的频率和速度必须是合适的,否则出现骨质形成不良或提前愈合等并发症。在牵张应力的强度相同时,手术截骨方式对骨延长的进程和预后影响并不完全相同。目前牵张应力的机械力学刺激如何转化为骨质再生的机理并不清晰,骨延长的分子生物学机制至今尚不明确。目的分别在不同强度的周期性牵张应力和持续性牵张应力作用下,观察体外培养的成骨细胞增殖情况和成骨相关的骨钙素基因、诱生型一氧化氮合酶基因的表达状况。牵张应力强度相同时,观察骨延长患者血清诱生型一氧化氮合酶的动态表达。探讨牵张应力强度影响成骨细胞增殖以及牵张成骨和骨延长的分子生物学机理。牵张应力强度相同时,探讨骨膜外剥离的胫骨近侧干骺端皮质骨截骨(A组)、骨膜下剥离的胫骨近侧干骺端皮质骨截骨(B组)和骨膜下剥离的胫骨近侧干骺端完全截骨(C组)三种临床手术截骨方式的成骨过程、矿化时间、骨愈合指数等新生骨形成速度和质量的差异,为临床肢体均衡手术提供优良技术手段。第一部分:牵张应力对成骨细胞增殖和成骨相关基因表达的影响实验一周期性牵张应力对成骨细胞增殖和骨钙素基因表达的影响方法从新生SD大鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,104个/cm2密度接种至细胞加力板上,随机分为4组,每组8份。培养24小时成骨细胞贴壁生长后,A组采用1000mstrain的周期性牵张应力;B组采用2000mstrain的周期性牵张应力;C组采用3000mstrain的周期性牵张应力;D组作为空白对照,采用0mstrain的牵张应力。4组牵张应力的刺激时间均为12小时,周期性牵张应力的刺激频率均为0.2Hz。周期性牵张应力刺激12小时后提取成骨细胞RNA,RT-PCR一步法分析成骨细胞骨钙素m RNA的表达,放射免疫法测定成骨细胞培养上清液中骨钙素含量,MTT法测定成骨细胞增殖率。结果A组、B组、C组与D组细胞骨钙素基因表达比值分别为0.421±0.022、0.446±0.015、0.361±0.018、0.415±0.014;细胞培养上清液中骨钙素含量分别为(3.201±0.216)ng/ml、(3.457±0.096)ng/ml、(2.641±0.019)ng/ml、(3.159±0.322)ng/ml;细胞增殖率分别为0.2869±0.0079、0.2971±0.0105、0.2778±0.0084、0.2861±0.0125。B组、C组与D组比较,成骨细胞增殖率、骨钙素基因表达比值和细胞培养上清液中骨钙素含量,差异均有统计学意义(P<0.05);A组与D组比较,成骨细胞增殖率、骨钙素基因表达比值和细胞培养上清液中骨钙素含量,差异无统计学意义(P>0.05)。实验二持续性牵张应力对成骨细胞增殖和诱生型一氧化氮合酶基因表达的影响方法从新生SD大鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,104个/cm2密度接种至细胞加力板上,随机分为4组,每组8份。培养24小时成骨细胞贴壁生长后,A组采用1000mstrain的持续性牵张应力;B组采用2000mstrain的持续性牵张应力;C组采用3000mstrain的持续性牵张应力;D组作为空白对照,采用0mstrain的牵张应力。4组持续性牵张应力的刺激时间均为48h,频率均为0Hz。噻唑蓝(MTT)法测定成骨细胞的增殖率;提取成骨细胞RNA,RT-PCR一步法分析成骨细胞诱生型一氧化氮合酶(i NOS)m RNA的表达,硝酸还原酶法测定成骨细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的含量。结果A组、B组、C组与D组细胞增殖率分别为0.2823±0.0138、0.3751±0.0408、0.2159±0.0154、0.2796±0.0222;成骨细胞诱生型一氧化氮合酶m RNA基因表达比值分别为0.490±0.011、0.543±0.048、0.457±0.012、0.486±0.009;细胞培养上清液中一氧化氮含量分别为(14.47±0.39)μmol/L、(16.47±0.38)μmol/L、(12.28±0.41)μmol/L、(14.32±0.37)μmol/L。B组、C组与D组比较,成骨细胞增殖率、诱生型一氧化氮合酶m RNA基因表达和细胞培养上清液中一氧化氮的含量,差异均有统计学意义(P<0.05);A组与D组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分:牵张应力对人血清诱生型一氧化氮合酶的影响方法2012年10月至2015年6月,单侧胫腓骨截骨后使用环形外固定器的胫腓骨延长组患者12例。手术前3天、术后第3天、7天、8天、11天、30天、停止延长时、停止延长第3天、停止延长第15天和30天、拆除外固定延长器时、拆除外固定延长器后30天,使用人诱生型一氧化氮合酶ELISA试剂盒,双抗体夹心法分别进行血清诱生型一氧化氮合酶浓度的动态检测。设立年龄相匹配的对照组12例,与实验组相同时相分别进行血清诱生型一氧化氮合酶浓度的动态检测。结果骨延长组牵张成骨操作开始第1天时,血清i NOS浓度即开始逐渐升高,i NOS高峰期位于停止牵张成骨时,骨延长期各个观察时间点与正常对照组相同时间点的i NOS相比,均有显著性差异(P<0.01)。停止延长3天时的血清诱生型一氧化氮合酶的浓度亦高于正常对照组,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。手术前3天、术后第3天和7天、停止延长第15天和30天、拆除外固定延长器械时、拆除外固定延长器后30天的血清诱生型一氧化氮合酶浓度与正常对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。第三部分:牵张应力强度相等时皮质骨截骨和完全截骨影响骨延长新生骨质量的临床研究方法96例单侧胫腓骨短缩畸形胫腓骨截骨后使用环形外固定器骨延长患者,随机分为A、B、C三组。牵张应力强度和致病机理相同,胫腓骨截骨位置和延长长度4.9-5.1cm基本一致,三种胫骨截骨方式中骨膜、松质骨、骨髓的损伤情况不同,探讨骨膜外剥离的皮质骨截骨(A组)、骨膜下剥离的皮质骨截骨(B组)和骨膜下剥离的皮质骨、松质骨和髓腔完全截骨(C组)三种截骨方法对骨延长术后相同阶段的新生骨骨密度、矿化时间、愈合指数的影响。结果1 A、B、C三组延长期、矿化期和塑形期新生骨骨密度结果延长期第30天和60天、矿化期第30天和90天、塑形期第30天和60天,A、B、C三组新生骨骨密度比较,A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05);A组骨密度较C组增高,两组之间差异有统计学意义(P<0.05);B组骨密度较C组增高,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。2 A、B、C三组新生骨矿化时间结果矿化期A、B、C三组再生胫骨段新生骨矿化时间比较:A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05);A组矿化时间较C组减少,两组之间差异有统计学意义(P<0.05);B组矿化时间较C组减少,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。3 A、B、C三组新生骨愈合指数结果三组新生骨愈合指数比较,A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05);A组愈合指数较C组减少,两组之间差异有统计学意义(P<0.05);B组愈合指数较C组减少,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论1周期性牵张应力强度不同,成骨细胞增殖和骨钙素基因表达结果各异。适当的周期性机械力学刺激通过成骨细胞骨钙素m RNA的高表达转换为成骨细胞增生的生物学信息可能是牵张成骨和骨延长的分子生物学机理之一。2持续性牵张应力强度大小不一样时,成骨细胞增殖和诱生型一氧化氮合酶基因表达有不同结果。适当的持续性机械力学刺激通过成骨细胞诱生型一氧化氮合酶m RNA的高表达转换为成骨细胞增生的生物学信息是牵张成骨和骨延长的又一个分子生物学机理。3牵张成骨的机械力学刺激能促进人血清诱生型一氧化氮合酶的高表达,是临床骨延长的生物学机理之一。4牵张应力强度相同时,人胫骨近侧干骺端皮质骨截骨术的骨延长新生骨质量优于完全截骨手术方式的新生骨质量。5骨膜外剥离和骨膜下剥离对胫骨近侧干骺端皮质骨截骨的骨延长新生骨质量无明显影响。