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QKI是属于STAR(signal transduction and activation of RNA)家族的一种RNA结合蛋白,在进化过程中高度保守,在神经系统发育过程中参与髓鞘发育,及胚胎发育中的心血管系统发育。Qki基因不同部位的突变体小鼠可以表现在出生前死于心血管肌肉系统发育障碍,或于出生后10 天表现为快速的震颤以及到了成年强直性惊厥的发作 。
Qki 基因长度大约为65kb ,含有9 个外显子,通过不同的剪接可以产生至少5 个转录子Kondo(1999) 发现含量较高的是5kb (qkI-5) 、6kb (qkI-6)和7kb ( qkI-7) , 分别编码产生QKI-5 、QKI-6 和QKI-7 三种蛋白质。它们拥有共同的KH 结构域及其两侧的QUA1 和QUA2 结构域,但羧基端和3’非翻译区各不相同。其中QKI-5 主要定位于胞核中,QKI-6,QKI-7 主要定位于胞浆中。
Pilotte 等发现QKI-7 可以引起成纤维细胞和原代培养的大鼠少突胶质细胞发生凋亡,它的致凋亡序列是位于羧基末端的14 个氨基酸残基,QKI-5 和QKI-6 不但不能诱导凋亡,反而可以与QKI-7 形成二聚体,并转移到细胞核内,抑制QKI-7 的致凋亡作用[7] 。另外许多有关QKI的功能研究大都集中在神经系统,特别是与髓鞘发育相关的分子机理方面。
NFKappaB 作为一种氧化还原敏感的转录因子在胚胎的发育过程中发挥着关键的作用,并且可以调节许多与炎症有关的基因的表达。
NFKappaB 的激活可以通过促进一些基因的表达来启动炎症的发生,这些基因包括细胞因子,白细胞黏附分子以及化学趋化因子等基因。
因此NFKappaB 在一些与炎症有关疾病的发生发展过程中有着重要的作用,其中包括动脉粥样硬化,炎症性肠病,自身免疫性关节炎,肾小球肾炎,败血性休克,肿瘤的发生等等。另一方面,qki 基因特定部位的突变会导致胚胎心血管系统严重的发育障碍。其次,对qki 基因启动子区进行分析,具有NFKappaB 的结合位点。最后,通过生物信息学预测,QKI 作为一种RNA 结合蛋白,有一些与炎症有关的靶分子,如VCAM ,COX-2 等等。但有关QKI 参与心血管发育及炎症发生发展过程中的分子机理,具体的还完全不清楚。
为了进一步研究在心血管发育及炎症发生发展过程中,qki在外界不同信号刺激下表达水平的变化,首先我们构建了qki基因启动子的荧光报告系统,并构建了不同的启动子截短体,从启动子水平证实了炎症刺激因子TNF对qki的调控作用,其次通过RT-PCR初步探索了qki在TNF刺激下的转录水平的变化。最后表达并纯化了6×His -QKI-7 融合蛋白,制备了高特异性的多克隆抗体 。由于QKI不同的剪接体之间有90%以上的氨基酸同源序列,有几乎相同的抗原表位,因此利用6×His-QKI-7 融合蛋白所制备的多克隆抗体可以识别QKI不同的剪接体,其实是针对各种QKI蛋白的多克隆抗体 。我们利用所制备的QKI蛋白的多克隆抗体同样检测了TNF刺激下的qki基因表达水平的变化。此外,我们还比较了利用三种不同的免疫佐剂制备QKI多克隆抗体的效果 。
主要研究结果包括:
1.首先我们克隆了qki 基因翻译起始位点ATG 上游序列并构建荧光报告系统,通过检测荧光素酶的活性证明该报告系统有启动子活性。
通过NCBI 基因组数据库查找到基因ATG 上游约2165bp 序列,利用PCR 技术扩增该片断,将其克隆到pGL3-BasicVector 中,插入到荧光素酶报告基因上游多克隆结合位点处,这样当检测到荧光素酶报告基因的表达,就说明克隆的片断存在启动子序列或转录调控序列。
我们将构建的启动子区荧光报告系统(QP-luc,pBind)转入Hy906和293 细胞中,显示荧光素酶的表达,说明克隆的qki 基因ATG 上游序列含启动子活性。通过TNF 和其下游NFKappaB 的活性亚单位P65刺激可以使启动子活性降低,用IkappaB mutant form 可以阻断TNF对QKI 基因启动子活性的下调作用。
2.将克隆的启动子区依照所预测的NFKappaB 结合位点依次截短,构建分别包含3,2,1 个NFKappaB 结合位点的qki 启动子截短体,通过TNF 及其相关信号途径分子的刺激和阻断进行启动子活性的分析。
对克隆的约2kb 片段进行启动子区预测,发现四个可能的NFKappaB 结合位点。因此,构建qki 基因启动子区3 个5’端缺失体荧光报告载体QP3(1652bp,预测含有3 个NFKappaB 结合位点)、QP2(1083 bp,预测含有2 个NFKappaB 结合位点)、QP1(968 bp,预测含有1 个NFKappaB 结合位点)。将构建的各启动子荧光报告系统转入真核细胞中,结果显示三个截短体荧光素酶表达在TNF 和其下游NFKappaB 的活性亚单位P65 刺激下均有降低,QP4 和QP1 用IkappaB mutant form 可以阻断TNF 对qki 基因启动子活性的下调作用。
提示克隆的最短序列QP1(968 bp,计算机分析证实该序列中含有一个NFKappaB 结合位点)可能是含有活性NFKappaB 结合位点qki 基因启动子的最短区域。
3.通过RT-PCR 检测TNF 作用下不同时间点qki 基因的转录水平的变化,结果提示TNF 作用24 小时内qki 基因的转录水平呈先降低后升高的趋势。
4.通过western-blot 检测TNF 作用下不同时间点qki 基因的表达水平的变化,结果提示TNF 作用16 小时内qki 基因的表达水平呈逐渐降低的趋势。
5.QKI 的原核表达纯化和多克隆抗体的制备。将已成功插入QKI-7编码区cDNA 并测序正确的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3) 感受态细胞细菌,以IPTG 诱导6×His-QKI-7 融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱,反向柱和强阴离子交换柱层析纯化。经SDS-PAGE 、Western blot 鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂,聚丙烯酰胺凝胶,NC 膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。由于QKI 不同的剪接体之间有90%以上的氨基酸同源序列,有几乎相同的抗原表位,因此利用6×His -QKI-7 融合蛋白所制备的多克隆抗体可以识别QKI 不同的剪接体,其实是针对各种QKI 蛋白的多克隆抗体。Western blot 鉴定抗体的效价和特异性。综上所述本研究通过构建qki 启动子区荧光报告系统并通过荧光素酶检测及RT-PCR,Western blot 初步确定TNF 对qki 基因启动子区活性,转录水平和表达水平的调控作用,证明了NFKappaB 参与该基因表达调控。此外为进一步研究在炎症发生过程中,qki 在外界不同信号刺激下表达水平的变化,表达并纯化了6×His -QKI-7 融合蛋白,制备了高特异性的多克隆抗体。