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目的:人类血小板特异性同种异体抗原(human platelet-specific alloantigen,HPA)是由血小板糖蛋白携带的,主要位于人血小板细胞膜的一大类抗原,其基因具有单一核苷酸多态性(single nucleotide polymo-rphism,SNP)。血小板制品在临床上的应用日益广泛,在临床输注过程中,由于血小板特异性抗原不相合而发生血小板同种免疫反应,产生血小板同种抗体,导致同种免疫性血小板减少,诱发如输血后血小板减少性紫癜(PTP)、血小板输注无效(PTR)及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜(NAITP)等疾病,同时在临床移植中还会引起移植排斥等相关疾病。在新生儿同种免疫血小板减少性紫癜(NAITP)和输血后血小板减少性紫癜(PTP)疾病中,HPA抗体是主要致病原因。对一些随机输注血小板而产生血小板输注无效的患者,输注HLA抗原相容的血小板也未能使病情好转;在一些血小板输注无效患者体内,没有检测到淋巴细胞毒抗体,这两点都提示抗血小板特异性抗体存在于这些患者体内,因此准确鉴定和检测HPA,不管是对于临床医学还是输血实践都具有非常重要的意义。[1-6]大量群体遗传学研究表明,HPA基因的分布具有明显的种族和地域的差异。随着成分血在临床上的应用,HPA基因频率的调查对于临床输血实践具有重要的意义,有助于解决血小板输注无效的难题,同时可以根据基因频率分布预测不同地区,不同种族间血小板特异性同种免疫的发生概率。目前,国内现有的关于中国人群HPA系统的基因多态性研究报道甚少,并且没有关于河北汉族人群的较大样本量精确的基因分型数据资料。本研究的目的在于应用PCR-SSP的方法,研究河北地区汉族人群血小板捐献者基因的多态性和分布特征,探讨河北地区汉族人群HPA基因频率,建立本地化的血小板捐献者资料库,为患者提供相配合的血小板,避免产生同种抗体,预防血小板输注无效的发生。方法:1制备基因组DNA:标本来自随机抽取的河北籍汉族健康无血缘关系的血小板捐献者930名,用EDTA抗凝管采取静脉血5ml,采用TIANGEN血液基因组DNA纯化试剂盒提取DNA。提取得到的DNA进行纯度和浓度测定,应满足OD260/OD280比值为1.7-1.9,浓度30ng/μl左右。2等位基因分型:采用天津秀鹏生物技术开发有限公司人类血小板同种抗原1-17基因检测试剂盒,依据NCBI Gene Bank目前拥有的HPA等位基因序列,运用PCR-SSP方法对HPA1-17等位基因系统进行分型。3 PCR产物凝胶电泳分析:将PCR扩增产物转移至琼脂糖凝胶电泳,在紫外/凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像,根据提供的引物孔位图解释分型结果。4统计学处理:基因频率采用基因直接计数法进行计算,并进行Hardy-Weinberg(HW)检验验证吻合度。HPA各系统对偶抗原不配合率采用公式P=2ab(1-ab)计算。(a,b分别代表a和b基因频率)河北地区930名汉族人群HPA基因频率与国内其他地区汉族人群以及国外其他地区人群基因频率的比较采用χ2检验,检验水准P设为0.05。结果:1 930名河北地区汉族血小板捐献者的HPA基因型检测结果如下HPA-1aa 919人,HPA-1ab 11人,HPA-1bb 0人;HPA-2aa 861人,HPA-2ab 69人,HPA-2bb 0人;HPA-3aa 339人,HPA-3ab 421人,HPA-3bb 170人;HPA-4aa 928人,HPA-4ab 2人,HPA-4bb 0人;HPA-5aa 911人,HPA-5ab 19人,HPA-5bb 0人;HPA-6aa 919人,HPA-6ab 10人,HPA-6bb 0人;HPA-15aa 294人,HPA-15ab 358人,HPA-15bb 278人;在HPA-7,8,9,10,11,12,13,14,16,17位点上,930名血小板捐献者的基因型均为aa纯合子,未检测到b基因。2 930名河北地区汉族血小板捐献者的HPA基因频率如下HPA-1a基因频率为99.41%,HPA-1b基因频率为0.59%;HPA-2a基因频率为96.29%,HPA-2b基因频率为3.71%;HPA-3a基因频率为59.09%,HPA-3b基因频率为40.91%;HPA-4a基因频率为99.89%,HPA-4b基因频率为0.11%;HPA-5a基因频率为98.98%,HPA-5b基因频率为1.02%;HPA-6a基因频率为99.46%,HPA-6b基因频率为0.54%;HPA-15a基因频率为50.86%,HPA-15b基因频率为49.14%;HPA-7a,8a,9a,10a,11a,12a,13a,14a,16a,17a基因频率为100%,其相应b基因频率为0。结论:1经过大量样本的实验操作,证明PCR-SSP的方法为进行HPA抗原检测的首选方法。2 HPA等位基因在人群中的分布具有种族和地域的差异,该基因在河北汉族人群中具有非常丰富的多态性,河北地区汉族人群HPA-3,15的不配合率较高,均超过37%,在血小板输注中产生抗体的机会也较高,推测HPA-3,15是河北地区汉族引起血小板输血反应的主要原因,在血小板输注中需给予关注。3河北地区汉族人群HPA基因频率在与国内外其他地区HPA-1-6,15基因多态性分布的比较分析中发现,HPA-1,3,15与国内大部分区域没有统计学差异,但HPA-1与欧洲,美国黑人有统计学差异,HPA-2,5与国内大部分区域及国外均有统计学差异,说明河北地区HPA基因分布有其独自的特点。4本次研究调查的河北地区汉族人群HPA基因频率数据为建设河北地区血小板供者库奠定了基础,为解决血小板输注无效迈出了重要的一步,同时为人类学及本地区群体遗传学等方面的研究提供了参考资料。