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背景与目的： 巨噬细胞在机体的抗肿瘤免疫中有重要的作用：①免疫监视功能，能够识别和清除衰老和变异的细胞；②抗原提呈功能，能够将加工过的抗原和MHC-Ⅱ类分子结合，和其它细胞表面信号一起激活辅助性T细胞；③非特异性免疫杀伤效应；巨噬细胞不但能够通过抗原提呈激活T细胞增强机体的特异性抗肿瘤免疫，而且可以通过与肿瘤细胞的密切接触，非特异性杀伤肿瘤细胞。 在被激活后，巨噬细胞可释放一系列的细胞因子及生物活性物质，如IL-1、IL-2、TNF-α、NO等，对机体的抗肿瘤免疫起到非常重要的调节作用。充分利用和调动这些功能在肿瘤生物治疗中的作用受到重视。静止的巨噬细胞不具备这些功能，巨噬细胞只有被激活后才有吞噬功能和分泌生物活性物质的能力。IFN-γ是巨噬细胞强有力的活化因子，可由激活的T细胞、NK细胞或巨噬细胞自身分泌。IFN-γ和巨噬细胞表面受体结合并使受体发生二聚化后，受体的胞内近膜区与胞浆内非受体酪氨酸蛋白激酶JAK(janus kinase)结合并发生磷酸化，进而与信号转导和转录激活因子(STAT)相结合。在JAK的催化下，STAT中的酪氨酸磷酸化，并结合成二聚体转移到核内，与DNA启动子的活化序列结合，启动基因的表达，产生多种生物活性物质。 IFN-γ的分泌可以增强抗原提呈细胞MHC-Ⅱ类抗原的表达及多种细胞MHC-郑州大学2003年硕士毕业论文小鼠IFN一丫真核表达载体的构建和转染鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究I类抗原的表达。因而可以促进Th细胞与APC以及cTL与靶细胞的识别及相互作用。IFN一丫的表达对ThZ细胞的增殖有抑制效应，但对Thl细胞却没有此效应，这种差别可能与Th，细胞缺失IFN一Y受体链的信号转导表达有关。此外IFN一Y对维持幼稚型T细胞对工L一12的反应是必需的。这有利于Th，细胞的分化，从而增强肿瘤的特异性细胞免疫。IFN一Y对NK细胞有强的激活作用，激活的NK细胞可以非特异性杀伤肿瘤细胞。IFN一Y在激活巨噬细胞分泌TNF一。的同时，还可以上调肿瘤细胞TNF一a受体的表达，增强TNF一Q的抑瘤作用，能够增强靶细胞对CTL和NK细胞的敏感性。 早期将巨噬细胞体外活化后回输到体内治疗肿瘤的过程中，IFN一Y和LPS常被用来作为巨噬细胞的体外活化因子。但由于体外培养的巨噬细胞吞噬活性丧失很快(每小时约丧失3%)，体外培养体内回输的应用受到限制。治疗效果不理想。本实验构建了小鼠IFN一丫的真核表达载体，并将此载体在体外转染小鼠腹腔巨噬细胞，并在荷瘤小鼠腹腔内注射重组表达载体，观察抗肿瘤效应。实验方法: 1.小鼠IFN一Y真核表达载体的构建: 无菌收集小鼠脾脏淋巴细胞，培养于含10%胎牛血清的RPMll640培养液中 (100 pg/m 1 PHA)培养4h。1000 rPm离心收集培养的细胞，按上海生工试剂盒方法提取总RNA。设计两套引物，采用RT一PCR、巢式PCR扩增提取的总RNA得到 IFN一Y的cDNA，将此cDNA和PGEM一T载体连接，用蓝白筛选的方法初步筛选，用PCR的方法进一步鉴定。将鉴定得到的重组质粒进行扩增，双酶切后回收目的片段和双酶切的pcDNA3.1质粒相连接，筛选得到重组的真核表达载体PcDNA3.1一工FN一Y。质粒的提取、纯化、感受态细胞制备、转染、蓝白筛选均参照《分子克隆实验指南》进行。 2.小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养: 取20克左右的雄性昆明小鼠，脱臼处死，消毒小鼠腹部，沿注入3ml冰预冷的PBSH(含1 ou/ml肝素和10%胎牛血清)。轻轻按摩小鼠腹部，无菌切开腹壁，用吸管吸出腹腔液体，再用同样体积的冰预冷的PBSH冲洗腹腔3次。将腹腔液体收集到离心管中，1000 rpm离心10 min，弃去上清。用预冷的适量郑州大学2003年硕士毕业论文小鼠IFN一丫真核表达载体的构建和转染鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤效应研究RPMn64O培养液洗涤细胞3次。用sml RPMll创0培养液重悬细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞的活力。然后置于37℃、器C02的培养箱内培养。 3.pcDNA3.1一IFN一丫质粒腹腔内注射 制备磷酸钙转染液，在肿瘤细胞接种到小鼠腹腔的第七天将IFN一丫基因转染液500 pl(含pcDNA3.l一IFN一Y质粒20 pg)注射到小鼠腹腔。同时设立PcDNA3.1空质粒对照组、磷酸钙转染液对照组和生理盐水对照组。 4.巨噬细胞IPN一丫表达的检测和杀伤活性的检测 (1)RT一PCR法检测IFN一Y贝RNA的表达 peDNA3.1一IFN一Y质粒转染体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞。转染后24h去除转染液，加5ml RPMI 1640培养液继续培养24h，收集细胞，用PBS洗两次。用试剂盒提取总RNA。提取的总RNA加1 p IDNA酶消化30 mirl，RT一PCR检测表达的mRNA.同时设空质粒转染组和磷酸钙转染组。 (2)间接MTT法 pcDNA3.1一IFN一Y质粒转染体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞，转染后24h去除转染液，加5ml即Mll640培养液继续培养24h，吸去培养液到15ml的离心管中。1500 rPm离心10 min，取上清一20℃保存。同时取另一组小鼠腹腔巨噬细胞，贴壁纯化后，用上一组收集的培养液培养18h，然后收集巨噬细胞，以H22为靶细胞，把效靶比为20:1混匀混合培