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胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor1,IGF1)是分泌的细胞生长因子,对身体的正常生长、发育和维持非常重要。研究发现由肌肉拉伸或电刺激造成的机械损伤、运动诱发的肌肉损伤以及注射布比卡因等都会诱导IGF1发生可变剪接,其剪接变异体IGF1Ec的表达会迅速增加。有研究指出IGF1Ec羧基末端(C端)的24个氨基酸多肽(又称为MGF E肽)参与肌肉、神经、心脏等疾病的修复治疗,被认为是极有潜力的组织工程生长因子。然而现有关IGF1Ec结构与功能的研究不是十分深入,并且MGF E肽对肌肉功能的研究还存在诸多分歧和争议。因此,我们尝试对IGF1剪接变异体IGF1Ec的结构和功能进行深入系统的研究。本研究比较了IGF1Ec、IGF1和MGF E肽对成肌细胞增殖、分化和迁移的影响,系统阐明了IGF1Ec不同结构区域和细胞功能的关系,对IGF1Ec、IGF1和MGF E肽在肌肉组织修复再生中的应用具有重要意义;另一方面,利用GST-Pulldown联合质谱分析技术初步获得了IGF1Ec和MGF E肽的相互作用蛋白,为进一步探寻IGF1Ec和MGF E肽新的细胞膜受体和下游信号通路奠定基础;在机理研究的同时,利用点突变PCR技术对IGF1Ec基因序列进行优化,提高了IGF1Ec蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的产量,为工业化大量生产IGF1Ec蛋白提供了技术改进方案。本论文主要研究内容及结论如下:(1)IGF1Ec基因中存在的大肠杆菌BL21(DE3)稀有密码子极大地阻碍了IGF1Ec蛋白在该菌株中的表达。利用点突变PCR和重叠PCR的技术对IGF1Ec的基因序列进行了优化,构建了两个原核表达载体pGEX-4T-1/IGF1Ec(Mut54-56)和pGEX-4T-1/IGF1Ec(Mut-total)。这两个载体在BL21(DE3)中目的蛋白IGF1Ec的表达量显著高于pGEX-4T-1/IGF1Ec在Rosetta(DE3)中的表达。在获得IGF1Ec后,我们进一步在成骨细胞中检验其生物活性。结果显示低浓度的IGF1Ec即可显著增强成骨细胞增殖和迁移能力,并且一定程度上抑制成骨细胞分化水平。因此我们获得的IGF1Ec具有较高的生物活性。(2)比较了IGF1Ec、IGF1和MGF E肽对成肌细胞C2C12的行为的影响。实验结果显示a.IGF1Ec和IGF1可以促进细胞的增殖,而MGF E肽则对细胞增殖没有影响;b.IGF1Ec、IGF1和MGF E肽都能促进成肌细胞肌管融合,但IGF1Ec的促进效率明显高于IGF1;c.IGF1Ec、IGF1和MGF E肽都能够促进迁移,但IGF1Ec和MGF E肽促迁移能力明显高于IGF1。随后我们用抑制剂封闭IGF1受体(IGF1Receptor,IGF1R),对其信号通路进行了研究。实验结果显示,对于细胞增殖效应,IGF1Ec和IGF1都是通过IGF1R激活介导的;对于细胞迁移效应,IGF1只通过IGF1R激活介导,而IGF1Ec和MGF E肽除了通过IGF1R激活介导,还存在其他受体参与。因此,我们认为IGF1Ec的不同结构区域具有不同的细胞生物学功能:氨基端(N端)的IGF1的序列,主要影响细胞增殖;C端的MGF E的序列,主要影响细胞分化和迁移。(3)设计合成了重组蛋白IGF1-24。该重组蛋白包括N端IGF1的氨基酸序列和C端的MGF E肽氨基酸序列两部分。通过比较重组蛋白IGF1-24和IGF1Ec对成肌细胞C2C12细胞行为的影响,发现IGF1-24对细胞的增殖、分化、迁移等细胞行为的作用同IGF1Ec非常相似,并且引起的生物学效应对IGF1R依赖性也是基本相同。因此,我们的实验结果进一步证明IGF1Ec对细胞行为的影响是通过N端IGF1的序列和C端MGF E肽的序列共同完成的。(4)对IGF1Ec在细胞内和细胞外存在形式的研究结果显示:细胞内只检测到IGF1Ec蛋白一条带,表明IGF1Ec在细胞内没有被蛋白酶裂解;在细胞外同样只检测到IGF1Ec一条带,表明分泌出胞外的IGF1Ec同样没有被蛋白酶裂解。因此,我们认为IGF1Ec并不是通过裂解为成熟IGF1和E肽来发挥功能,而是作为一个整体蛋白来发挥功能。(5)通过GST-Pulldown联合LC-MS/MS质谱分析的方法检测了分别与IGF1Ec和MGF E肽相互作用的蛋白,发现其中有46个只与IGF1Ec和MGF E肽相互作用,而不和IGF1相互作用。利用GOEAST和DAVID基因功能分析软件对这些蛋白进行了生物信息学分析,结果显示这些蛋白参与调控细胞的许多生物学过程,如蛋白合成、蛋白转运、细胞迁移、细胞连接和细胞分化等。