多肽类药已用于免疫性疾病肿瘤、糖尿病等疾病的治疗,近年来是药物发现与开发的热点。但是,多肽类药物也有其不足,如:稳定性差;受外界因素如温度、pH值的变化等因素影响较大;在体内易被酶解破坏等。多肽的这些特性给从事多肽类药物研究的人员提出了新的课题和挑战。在临床使用中,该类药物多制成冻干粉针剂用于临床,近年来也有关于研究开发微球微囊缓释制剂和脂质体新剂型的文献报道。胸腺素α1(thymosin α1,Tα1)和胸腺五肽(thymopentin,TP5)是从动物胸腺中得到的两种多肽。TP5的体内半衰期(t1/2)很短,只有30s;Tα1的体内半衰期(t1/2)较长,约为100 min。为延长TP5的t1/2,将具有相似生物活性与临床用途的Tα1和TP5借助基因工程技术连接在一起,在大肠杆菌中进行规模化表达,得到胸腺素α1-胸腺五肽融合肽(Tα1-TP5融合肽)。在前期初步药理学研究中,Tα1-TP5融合肽展现了良好的免疫调节和辅助抗肿瘤活性,基本具备辅助抗肿瘤药物开发的潜力。本课题组在前期大量实验研究工作的基础上,进行了中试规模Tα1-TP5融合肽的制备工艺研究,完成由实验室向规模化生产的技术转移;对注射用Tα1-TP5融合肽冻干粉针剂的制备工艺进行研究并确定产品冻干工艺曲线;完成Tα1-TP5融合肽原料药及制剂的质量研究、方法学验证,初步拟定产品质量控制标准;对中试规模生产的三批样品进行6个月的长期稳定性考察。本研究为将Tα1-TP5融合肽开发成一种新型的免疫调节剂和辅助抗肿瘤药物奠定了重要的基础。1中试规模Tα1-TP5融合肽的表达与纯化条件的优化研究本课题采用大肠杆菌表达体系对Tα1-TP5融合肽进行规模化表达,通过工艺优化,对表达条件、纯化工艺等进行系统研究,生产出了中试规模水平的Tα1-TP5融合肽,完成了制备工艺由实验室研究向规模化生产的技术转移。由于Tα1-TP5融合肽无糖基化、磷酸化等修饰,也无二硫键形成的肽段,较适合采用大肠杆菌重组表达体系进行规模化制备。以构建好的含有重组载体pTYB2-Tα1-TP5-Sce intein-CBD的大肠杆菌工程菌株ER2566-Tα1-TP5和目标化合物Tα1-TP5融合肽为研究对象,优化了适合中试规模生产的Tα1-TP5融合肽重组表达及内含肽介导的纯化制备体系。研究表明,大肠杆菌工程菌株ER2566-Tα1-TP5表达Tα1-TP5融合肽的最佳条件为:菌体干重10 g/L时加入终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂IPTG,28℃诱导表达5 h。采用内含肽介导的纯化策略制备Tα1-TP5融合肽,以降低纯化成本及提高纯化效率。确定重组蛋白Tα1-TP5-Sce intein-CBD在亲和几丁质柱填料的最佳上样量为15 mg/ml,切割完成后使用2倍柱体积的洗脱液进行洗脱可回收获得90%以上的融合肽;按照Tα1-TP5融合肽诱导表达及纯化的最优条件,先后规模化制备3批纯度大于95%的Tα1-TP5融合肽样品,样品的批产量分别为2.16 g、2.10 g 和 2.20 g。2注射用Tα1-TP5融合肽的处方及制备工艺研究依据国内外已上市类似产品的临床使用情况及处方组成对Tα1-TP5融合肽冻干粉针剂的制备工艺进行了研究,着重考察了注射用Tα1-TP5融合肽的冻干成型工艺,主要包括支撑剂的筛选、pH值的确定、冻干体积、活性炭用量、配液温度等工艺参数。通过对工艺参数筛选优化,确定注射用Tα1-TP5融合肽制剂的处方组成及制备参数为:以甘露醇为赋型剂,磷酸氢二钠溶液为酸碱度调节剂,pH值控制在6.0～8.0范围内,配液水温控制在30℃以下,活性炭用量0.1%(g/ml),装瓶量为每瓶1 ml;处方量:每1000支处方量Tα1-TP5融合肽1.0 g,甘露醇50.0 g,0.5 mol/L的磷酸氢二钠溶液适量调节pH值至6.8,注射用水加至1000 ml;制剂规格:1 mg(以含胸腺素α1-胸腺五肽融合肽计)。通过对冻干工艺进行研究,筛选出合适的制剂处方及生产工艺参数,按照优化的工艺参数制备中试规模(1000支/批)3个批次的注射用Tα1-TP5融合肽,证明该处方设计合理。确定了注射用Tα1-TP5融合肽冻干工艺、工艺流程及制剂的冷冻干燥参数,确定了该产品的冻干曲线。3 Tα1-TP5融合肽的质量研究研究建立Tα1-TP5融合肽原料药的质量控制方法和限度,为药物制剂处方的确定提供指导和依据。对3批Tα1-TP5融合肽原料药(批号:TT-20170601、TT-20170602、TT-20170603)的理化性质进行了研究;建立高效液相色谱法(HPLC)测定Tα1-TP5融合肽含量的方法,并进行了方法学研究。研究结果表明,本品在水中易溶,在甲醇、乙腈中极微溶,在乙酸乙酯中不溶;pH值范围为3.12～3.15;比旋度平均值为-96°;本品的溶液澄清无色;平均水分含量为1.30%。HPLC法测定Tα1-TP5融合肽含量,Tα1-TP5融合肽在0.479～1.367 mg/ml范围内线性关系良好(r=0.9998),定量限为19.14 ng/ml,检出限为 6.38 ng/ml;色谱条件:Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,磷酸氢二钠溶液-乙腈(9:1,v/v)为流动相,进样量为20 μl,检测波长为208 nm,流速为0.6 ml/min;以峰面积归-一化法测含量。该方法专属性强、重复性和精密度均较好、结果准确,测得3批Tα1-TP5融合肽样品的含量分别为99.122%、99.125%和99.190%。该方法可用于测定Tα1-TP5融合肽的含量。初步拟定Tα1-TP5融合肽原料药的质量标准,为更好的控制产品质量,保障药品的安全、有效、质量可控提供理论依据。4注射用Tα1-TP5融合肽的质量研究建立注射用Tα1-TP5融合肽的质量控制方法和限度,实现产品质量控制。对中试规模生产的3批(批号:20170801S,20170802S,20170803S;批量:1000支/批)注射用Tα1-TP5融合肽的理化性质进行了研究;对无菌、细菌内毒素、含量测定进行方法学验证,确定细菌内毒素和无菌检查方法,建立HPLC法测定注射用Tα1-TP5融合肽的含量。研究结果表明,本品为白色或类白色的疏松块状物;pH值范围为6.78～6.80;溶液澄清无色;平均水分含量2.42%。确定内毒素限量为每1 mg注射用Tα1-TP5融合肽中含内毒素应小于5.0 EU;采用薄膜过滤法进行无菌检查;采用HPLC法测定注射用Tα1-TP5融合肽的含量,方法学研究表明该法专属性好,在0.479～1.367 mg/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.9998),精密度高,方法重复性好;可用于测定注射用Tα1-TP5融合肽的含量。以峰面积归一化法计算样品的含量分别为98.872%、99.064%和99.124%。初步拟定了注射用Tα1-TP5融合肽的质量控制标准。5注射用Tα1-TP5融合肽制剂的稳定性研究通过对注射用Tα1-TP5融合肽的稳定性研究,为药品的生产、包装、储存、运输条件提供科学依据,同时依据稳定性试验数据制订产品有效期。对3批样品进行影响因素试验、加速试验和长期试验的稳定性考察。研究结果表明,影响因素试验结果显示,在高温60°℃条件下,单个杂质及总杂质显著增加,含量显著下降,提示本品在高温条件下不稳定;在光照度4500 Lx±500 Lx条件下放置10 d后,各项考察指标均未发生明显变化,表明本品对光照基本稳定。加速试验6个月,有关物质显著增加,含量显著下降,其它各项检测指标未发生显著性变化;表明注射用Tα1-TP5融合肽对高温条件不稳定,提示本品应在低温密闭条件下贮存。长期试验6个月,有关物质略有增加,含量略有下降,其它考察指标均无明显改变;表明本品在长期试验条件下基本稳定,拟定包装能够满足上市包装要求。本课题研究取得的主要成果有以下几个方面:(1)成功进行了 Tα1-TP5融合肽在大肠杆菌体系中的高效诱导表达;建立并优化适合中试规模生产的通过内含肽介导的Tα1-TP5融合肽纯化制备工艺,完成该活性肽由实验室水平制备研究向规模化工业生产的技术转移。(2)对注射用Tα1-TP5融合肽制剂的制备工艺进行研究,确定了注射用Tα1-TP5融合肽制剂的处方工艺条件及产品冻干曲线,制备出稳定性良好的3批样品。(3)建立了 Tα1-TP5融合肽原料药及制剂的质量控制方法和限度,初步拟定了质量标准。(4)通过对注射用Tα1-TP5融合肽的稳定性试验研究,确定产品的有效期。