研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是一种新出现的毒品类型。近年来，MA的滥用人数不断上升，全球滥用人数仅次于大麻，成为危害最为严重和广泛的毒品之一。MA属于苯丙胺类兴奋剂，具有多种药理、毒理学特性。近年来的研究显示，MA有较强的神经毒性，可导致大脑出现与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性病变相类似的改变，主要表现为脑组织多巴胺水平下降、多巴胺能神经轴索受损、酪氨酸羟化酶(TH)活性降低、多巴胺摄取位点(DA uptake sites)和单胺递质转运小泡(versicular monoamine transporters，VMAT-2)浓度下降、神经细胞凋亡。MA的神经毒性是一个多途径、多机制参与的过程，研究显示，氧化应激损伤作用、体温平衡失调、离子稳态破坏以及细胞凋亡相关通路的激活是MA神经毒性的可能机制；但现有的研究结果不足以充分阐释MA的神经毒性机制，目前对其毒性尚缺乏有效的的防治手段。目的：建立MA中毒动物模型，运用病理学、行为学、神经化学等方法，全面了解MA毒性作用；在此基础上，运用比较蛋白质组学方法，筛查脑组织中与MA毒性作用密切相关的差异表达蛋白质，根据蛋白质的功能，探讨MA的神经毒性机制。并根据研究结果，选择有意义的通路，作进一步研究。方法：1．MA中毒动物模型的建立和毒性观察Wistar大鼠40只，随机分为实验组和对照组。动物腹腔注射MA，剂量为15 mg／kg体质量，每天早8：00点、晚6：00点各注射一次，连续注射4天，共8次，制成MA中毒动物模型。观察动物的行为变化，体重、进食量、饮水量的变化和心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的组织学变化；高效液相色谱检测纹状体、海马、额叶皮质等部位脑组织多巴胺及其代谢产物含量；HE染色、Glees氏银浸染观察脑组织病理变化；GFAP免疫组化染色检测星形胶质细胞增生情况。2．甲基苯丙胺神经毒性机制的比较蛋白质组学研究采用双相电泳技术分离MA中毒大鼠和正常对照大鼠纹状体、海马、额叶皮质脑区蛋白质，筛选差异表达的蛋白质点，进行串联质谱鉴定，根据蛋白质的相关功能，探讨MA的神经毒性机制。3．氧化应激过程中NOS／NO在MA神经毒性机制中的作用研究根据上一部分的研究结果，MA导致氧化应激过程中，可能通过NOS活性的增高和产生过量NO导致神经毒性作用。本研究首先观察MA对脑组织NOS活性的影响，其次应用nNOS特异性的抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)，研究nNOS活性变化与MA神经毒性的关系。Wistar大鼠16只，随机分为生理盐水组、7-NI组、MA组、7-NI+MA组；用化学显色法检测生理盐水组和MA组大鼠纹状体NOS活性，测量各组大鼠体温变化和纹状体DA含量变化。4．MA神经毒性相关硝化靶蛋白质的鉴定应用双向电泳分离蛋白质结合western blot 3-硝基酪氨酸免疫显色(two-dementional 3-NT blot)技术，检测大鼠纹状体组织中硝化的蛋白质点，用串联质谱鉴定硝化蛋白质，根据蛋白质的功能，进一步深入探讨MA导致NO生成过量的神经毒性机制。结果1．MA注射后动物进食量明显减少(P＜0.001)，具有明显的食欲抑制作用，并可导致动物体重下降(P＜0.001)；MA导致动物出现明显的行为改变，主要表现为好动、易激惹等，动物刻板行为评分明显高于对照组(P＜0.001)。纹状体、海马、额叶皮质脑组织多巴胺含量下降(P＜0.001)，纹状体DOPAC／DA比值增高(t=5.133，P=0.045)。纹状体神经细胞周围水肿、神经元变性、轴索损伤，纹状体、海马胶质细胞增生。部分动物肝细胞水肿、脂肪变，肺间质充血，炎细胞浸润。2．通过比较蛋白质组学分析，分别在纹状体发现14个、海马12个、额叶皮质4个差异表达蛋白质，这些蛋白质分别与氧化应激、蛋白酶体功能、神经退行性变／凋亡和线粒体功能失调有关。三个脑区差异蛋白谱的变化各不相同，但部分蛋白质在两个或三个脑区同时表达上调或下调。3．MA注射组纹状体NOS活性显著高于生理盐水组(P=0.001)；7-NI不影响动物的体温，对MA导致的动物体温升高亦无降温作用(P＞0.05)；7-NI+MA组纹状体DA含量显著高于MA组(P＜0.001)。4．应用双向电泳分离蛋白质结合western blot 3-硝基酪氨酸免疫显色(two-dimensional 3-NT blot)技术，在大鼠纹状体组织中发现6个硝化蛋白质点，其中5个在MA作用后硝化增强；通过串联质谱鉴定出3个蛋白质：tropomodulin1，tropomodolin 2和mu-crystallin。其中前两个蛋白质是原肌球调节蛋白(tropomodulin，TMOD)的两种功能相似的亚型。TMOD通过与肌动蛋白结合，参与维持细胞骨架稳定性。mu-crystallin的功能尚未完全明了，可能参与调节神经元的分化成熟和氧化应激过程。结论1．MA具有明显的神经毒性作用，可造成纹状体、海马、额叶皮质等多脑区损伤和动物行为改变，并对肝、肺等器官有一定毒性作用。2．氧化应激、蛋白酶体功能异常、神经退行性变／凋亡、线粒体功能失调是MA神经毒性的主要机制；MA可通过相似的毒性损伤机制，对不同脑区产生毒性损伤作用。3．MA导致氧化应激过程中脑组织NOS活性增高，以及NO的过量生成，是MA神经毒性的重要机制。4．MA导致原肌球调节蛋白(tropomodulin)硝化后功能丧失，破坏神经元正常细胞骨架，可导致神经轴索损伤、神经细胞凋亡，并且可能与动物行为改变有关。脑组织NOS活性增高，NO的过量生成，导致神经细胞中重要结构蛋白的硝化损伤，是MA神经毒性的重要机制。