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背景:肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一,预后差,死亡率高,因为早期临床症状和体征不明显,患者往往在就诊时就已经处于中晚期,从而丧失手术根治的机会。对于晚期肝癌患者,全身化疗仍然是目前姑息治疗的唯一选择,SN38（7-乙基-10-羟基喜树碱）是一种有效的DNA拓扑异构酶I抑制剂,是临床最常用的化疗药之一伊立替康的活性代谢产物。但由于其表现出剂量限制的毒性,且在水中溶解度极低,因此其临床应用受到限制。且有研究表明,SN38能够上调STAT3的表达,而作为转录因子的STAT3具有强烈的致癌潜力。在CRC细胞中,上调的STAT3引起对SN38的抗性,并且STAT3的抑制能够显著增强SN38的细胞毒性作用。micro RNA的异常表达与包括肝细胞癌在内的人类癌症的发生和发展密切相关。已有研究表明mi R-124-3p的下调与临床阶段和患者生存不良有关。过表达mi R-124-3p可以通过下调STAT3的表达等途径从而促进肝癌细胞凋亡最终达到抑制肝细胞癌的发展。由于基于micro RNA的基因治疗和化疗药治疗存在相互叠加甚至协同治疗的能力,该种组合疗法已经被推荐用于多种肿瘤的治疗。脂质体作为一种常用的纳米递药载体,具有良好的生物相容性,能够高效的将药物运送到靶组织。利用脂质体纳米递药系统将化疗药与micro RNA联合递送至肝细胞癌并观察其治疗效果,未见报道。目的:本研究旨在通过脂质体纳米递药系统（liposome/lipo）同时将经过聚乳酸（PLA）修饰的SN38前药（SN38-PLA）和mi R-124-3p（即lipo-mi R/SN38-PLA）共递送至肝癌细胞中,从而达到能有效抑制肝癌细胞的增殖和裸鼠皮下瘤的生长,并且具有良好的生物安全性,为肝细胞癌的治疗提供新的思路。基于以上问题,我们的研究目的分为:1.构建稳定的脂质体纳米递药系统,将SN38-PLA与mi R-124-3p成功包被。2.探究lipo-mi R/SN38-PLA能否顺利被递送入肝癌细胞,并在体外实验中具有比单药治疗更好的抑癌效果。初步研究其抗增殖机制与内吞机制。3.探究lipo-mi R/SN38-PLA能否在体内实验中发挥出比单药治疗更好的抑癌效果,以及其生物安全性的评估。方法:第一部分将PLA通过酯键共价连接至SN38分子上,形成聚乳酸修饰的SN38前药（SN38-PLA）,利用SN38-PLA与DSPE-PEG2000,DOTAP（阳离子脂质体用磷脂,2,3-二油酰基-丙基）在水中自组装形成正电荷的lipo-SN38-PLA纳米粒,并与负电荷的mi R-124-3p通过静电吸附作用以不同比例在核酸电泳实验中进行筛选,制备出比例最佳的lipo-mi R/SN38-PLA纳米颗粒。对lipo-SN38-PLA纳米颗粒和lipo-mi R/SN38-PLA纳米颗粒进行粒径、Zeta电位、电镜观察等表征。利用核酸电泳实验对lipo-mi R/SN38-PLA在50%大鼠血清或RNA酶A中的稳定性进行评价。第二部分利用CCK-8实验检测SN38与mi R-124-3p联用的抗肝癌细胞增殖效果。通过克隆形成实验以及Ed U实验验证lipo-mi R/SN38-PLA对肝癌细胞增殖能力的影响。通过流式细胞术、荧光显微镜观察和PCR实验检测lipo-mi R对于mi RNA的运载到肝癌细胞内的效果。利用激光扫描共聚焦显微镜观察lipo-mi R/SN38-PLA与溶酶体是否有共定位以及通过流式细胞术检测,在加入不同内吞通路抑制剂后,肝癌细胞对lipo-mi R/SN38-PLA的摄取量的改变。通过流式细胞术以及AO/EB染色实验检测lipo-mi R/SN38-PLA诱导凋亡的效果。通过western blot实验检测SN38和mi R-124-3p对于STAT3以及Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白的表达调控作用。第三部分通过构建裸鼠皮下HCC-LM3移植瘤模型,测量移植瘤的体积和重量来验证lipo-mi R/SN38-PLA的抗肿瘤效果。利用裸鼠移植瘤切片行H＆E、Ki67、Tunel、STAT3染色,验证lipo-mi R/SN38-PLA的抗肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的效果以及对于STAT3的表达调控作用。通过检测裸鼠的体重和对lipo-mi R/SN38-PLA组裸鼠的心肝脾肺肾镜下的病理检测,来验证其在体内的生物安全性。结果:第一部分lipo-mi R/SN38-PLA纳米颗粒的粒径为219.3±6.2nm,Zeta电位为21.83±3.32m V,PDI为0.052±0.011,且具有良好的球形形态。在50%大鼠血清或RNA酶A中,都能够稳定存在,保护micro RNA不被快速降解。第二部分在不同SN38浓度下,SN38与mi R-124-3p联用组的抗HCC-LM3和Huh7增殖效果要优于SN38组或mi R组。在Huh7及HCC-LM3细胞系中,通过克隆形成实验以及Ed U实验显示出lipo-mi R/SN38-PLA组的集落数或增殖细胞数相较于SN38组、mi R组、SN38+mi R组均有明显的减少。通过流式细胞术、荧光显微镜观察和PCR实验观察到lipo-mi R组相较于转染试剂Trans-mi R组和free mi R组,进入胞内的mi R有较明显的增加。lipo-mi R/SN38-PLA与溶酶体存在共定位现象。加入氯丙嗪后,细胞对lipo-mi R/SN38-PLA的摄取量显著减少。通过流式细胞术以及AO/EB染色实验观察到,lipo-mi R/SN38-PLA相比于SN38或mi R-124-3p单用组,或SN38与mi R联用组,其对于HCC-LM3或Huh7细胞的诱导凋亡效果最好。通过western blot实验验证,在Huh7细胞中,SN38能够调STAT3的表达,且mi R-124-3p能够下调STAT3表达,两者联用后,其STAT3的表达量相较于SN38单用组有明显的降低。mi R-124-3p和SN38均能促进Huh7细胞Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达,且联用之后的表达量较之单用组均有明显的上调。第三部分相比于PBS组、CPT-11+agomir组、lipo-mi R组、lipo-SN38-PLA组,脂质体纳米药物lipo-mi R/SN38-PLA组对于裸鼠皮下瘤HCC-LM3的抑制作用最为显著（agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA,可以模拟内源性的micro RNA且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果,因此在动物实验中,使用agomir来替代常规的micro RNA）。该组的肿瘤体积均未超过500 mm3,肿瘤的重量也均未超过0.5g。H＆E染色中,PBS组的组织切片几乎看不到坏死和凋亡的肿瘤细胞,而CPT-11+agomir组、lipo-mi R组、lipo-SN38-PLA组均可看到部分的凋亡和坏死区域,其中lipo-mi R/SN38-PLA组肿瘤组织结构大部分被破坏,凋亡和坏死区域最大。Ki67染色中,与其他4组相比,lipo-mi R/SN38-PLA组的Ki67阳性细胞率最低。Tunel染色中,lipo-mi R/SN38-PLA组的凋亡细胞比率最高。组织STAT3染色后发现,lipo-mi R/SN38-PLA组和CPT-11+agomir组的STAT3的表达均较之lipo-SN38-PLA组有所减少,与细胞水平的表达一致。lipo-mi R/SN38-PLA治疗组在给药期间均无裸鼠体重的显著性下降,且该组裸鼠的心肝脾肺肾镜下均无明显的病理改变。结论:1.成功构建了基于SN38-PLA和mi R-124-3p的结构稳定、粒径均一的脂质体纳米颗粒lipo-mi R/SN38-PLA,该纳米颗粒有较好的稳定性,能够保护micro RNA不被快速降解。2.SN38与mi R-124-3p具有协同抗肝癌细胞增殖效果,主要通过对STAT3蛋白的表达调控而产生。且lipo-mi R/SN38-PLA在体外具有相比于单药更好的抗肝癌细胞增殖效果。lipo-mi R能高效的将mi R-124-3p递送进入肝癌细胞。lipo-mi R/SN38-PLA与溶酶体有共定位,且其主要经由网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。SN38与mi R-124-3p均可诱导细胞凋亡,引起Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达上调,且联用后效果更明显。3.lipo-mi R/SN38-PLA在裸鼠体内具有较好的抑瘤效果且有较好的体内生物安全性。在H＆E、Ki67、Tunel、STAT3染色中,lipo-mi R/SN38-PLA有更显著的抗增殖,促进凋亡效果,且在STAT3的表达上与细胞水平相符合。