近年来,大鲵疾病频发,为了确定重庆某大鲵养殖场患病大鲵的病原菌,并进行菌种鉴定及胞外酶活性研究,从具有典型症状的病鲵肝脏分离出一株菌株TNL12,根据形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA分析对菌株进行种类鉴定,通过人工感染试验确定病原菌株的致病性,利用平板法检测胞外酶活性。结果显示,所获菌株为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,其生理生化特性与弗氏柠檬酸杆菌一致。16S rDNA分析表明,TNL12与弗氏柠檬酸杆菌的同源性为99%,在系统发育树与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支。该病原菌可引起健康青蛙、大鲵出现感染症状,且感染症状与自然发病症状相似。胞外酶活性检测发现该菌可产卵磷脂酶、淀粉酶,但不产脂酶、蛋白酶、明胶酶、脲酶等胞外酶。这些研究结果表明,从患病大鲵中分离出的病原菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),且对大鲵有较强的致病性。在大鲵病害防治的过程中,由于抗生素的不合理使用,使许多病原菌对抗生素产生了一定的抗性,为研究有效防治大鲵疾病的方法,采用纸片扩散法研究所分离的病原菌对20种抗生素的敏感性。实验结果表明,本次分离的病原菌TNL12为弗氏柠檬酸杆菌,对林可霉素类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗生素有一定的耐药作用,而对大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素以及喹诺酮类抗生素则产生完全耐药性。为探索该病原菌的耐药机制,设计一系列引物对相关耐药基因进行检查,得出该弗氏柠檬酸杆菌中携带有耐大环内酯类抗生素基因MsrD以及耐β-内酰胺类抗生素基因Tem,尽管该细菌对喹诺酮类抗生素药物高度不敏感,但并未检测到相关的耐药基因,可能与核糖体突变有关。针对大鲵所患疾病,采用琼脂扩散法(平板打孔法)测定五味子等45种中草药对大鲵源弗氏柠檬酸杆菌的体外抑菌效果,并用二倍稀释法测定抑菌效果良好的25种中草药对该病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。实验结果显示：来源于病鲵肝脏的弗氏柠檬酸杆菌对五味子及乌梅高度敏感,对金银花、黄连、丁香等7种中草药中度敏感,对牡丹皮、杜仲等16中草药敏感性较弱,对泽兰等20种中草药则不敏感。此外,测定女贞子、丁香等抑菌圈大于10cm的中草药的MIC及MBC,其范围在7.81mg/mL～250mg/mL之间。综上所述,此次分离的弗氏柠檬酸杆菌已对多种抗生素产生耐药性,研究该病原菌的药敏性及耐药性特征,对研究大鲵疾病防治,寻找产生耐药性的原因有重大意义。同时,还能为研究耐药性的消除提供理论依据,为研制安全、绿色、无污染的中草药病害防治方法奠定基础。