【研究背景】充足的脑血流量对于维持大脑功能正常运转至关重要,慢性脑低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)表现为脑血流量持续减少,作为多种脑血管疾病发展的共同病理过程,可导致认知功能减退。然而,CCH致认知功能障碍发病机理不完全清楚,尚无特效药物和治疗手段,因此,积极寻找预防、治疗策略是临床亟待解决的重要课题。研究发现,CCH致认知功能障碍的机制复杂,主要的病理过程包括缺血导致细胞能量缺失、脑白质损伤、神经发生受损、血脑屏障破坏、脂质代谢和神经血管单元功能紊乱、细胞坏死和凋亡等。神经元作为CNS中最小的功能单元,一定数量及功能正常的神经元是学习记忆的基础。CCH中,神经细胞发生凋亡、坏死等一系列的病理生理学变化,进而导致大脑高级神经功能损伤,如运动功能损伤、认知能力下降等。CCH致神经元损伤,前额叶皮层(Prefrontal cortex,PFC)和海马(Hippocampus,Hipp)是最受关注的脑区,被认为是CCH后认知功能受损害的形态学基础。PFC和Hipp是参与空间学习记忆的中枢脑区,PFC和Hipp对缺血缺氧十分敏感,长期缺血导致该部位神经元功能和结构的损害;其结构异常与学习记忆能力等行为学改变关系密切,进而引起学习记忆能力的下降,甚至痴呆。因此,研发可促进脑缺血后PFC和Hipp区神经元存活的措施,如神经保护剂,对认知功能障碍的治疗具有重要意义。祖国医学一直致力于研究、开发用于CCH预防、治疗的药物,其中人参(Radix Ginseng)为常用的经典药物之一。人参隶属于五加科(Araliaceae),常用作功能性保健食品的替代或补充用药,亦用于抗癌、抗糖尿病和抗炎治疗;同时,人参具有良好的神经保护作用。人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd,GSRd)是人参中的主要活性成分之一,大量研究证实,GSRd保护脑缺血及神经退行性病变模型中的神经元、改善动物的空间学习能力并预防记忆丧失,但其基本的机制仍然未知。近期研究证实,人参皂苷的神经保护作用与脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的生成关系密切。BDNF是一种重要的神经营养蛋白,在神经可塑性、神经元再生和细胞存活中起关键作用,常于缺氧或缺血后释放以保护脑免受损伤。临床常用药物能够发挥增强记忆、神经保护作用等,部分得益于促进或提高BDNF的表达。然而,人参皂苷是如何调控BDNF、它是否可通过BDNF发挥神经保护作用目前尚不清楚。多种机制参与调控BDNF的表达,其中表观遗传学修饰机制因是多种分子的共同上游调控机制而备受关注。表观遗传学修饰机制包含组蛋白的乙酰化修饰、DNA的甲基化修饰、非编码RNA调控和染色质重塑等,影响基因表达、调节细胞周期等。其中,组蛋白乙酰化调控被证实参与动物学习记忆活动的形成和维持。组蛋白乙酰化为一种高度动态的调节过程,主要在两类酶,即组蛋白去乙酰基酶(Histone deacetylase,HDAC)和组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase,HAT)的作用下实现。一般情况下,HDAC抑制基因的表达,而HAT促进基因的表达。因此,本课题拟在小鼠CCH模型中,探讨GSRd是否可通过改变组蛋白乙酰化修饰,调控BDNF表达,从而发挥对PFC和Hipp区神经元的保护作用。【研究目的】以CCH小鼠为研究对象,探讨GSRd通过增加BDNF的生成,提高神经元存活,用于治疗CCH致认知功能障碍的分子机制。进一步,通过体外细胞培养体系模拟CCH病理状态,阐明组蛋白乙酰化修饰调控GSRd介导的BDNF生成过程、参与GSRd促神经元存活,从而改善CCH引起的学习记忆障碍的分子机制,为临床治疗CCH造成的认识功能障碍提供新思路和可能的治疗手段。【研究方法】1.微弹簧圈法造成双侧颈动脉狭窄(Bilateral Carotid Artery stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宫行为学评价CCH是否导致小鼠学习记忆功能障碍,进而给予GSRd治疗21 d,是否可改善CCH导致的小鼠学习记忆障碍。2.苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察,给予或不给予GSRd治疗CCH小鼠的PFC、CA1区域神经元形态、存活率变化;采用Western blot方法,检测CCH模型小鼠脑内凋亡信号Caspase-3蛋白表达的变化,并观察给予GSRd治疗后是否逆转这些蛋白的表达。3.实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)、酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测各组小鼠海马中BDNF的表达变化,探讨GSRd神经保护作用可能的机制。4.体外培养海马神经元,建立氧糖剥夺模型(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模拟CCH模型,采用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide,MTT)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)检测细胞活力、流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)检测神经元的凋亡现象,以及给予不同浓度梯度GSRd时神经元存活率的变化;采用Western blot方法,检测细胞内凋亡信号Caspase-3蛋白表达的变化,评估体外GSRd的神经保护能力。5.采用培养神经元OGD模型,q PCR、ELISA法,观察不同浓度梯度GSRd对BDNF表达量的影响。6.采用Western blot方法,检测给予或不给予GSRd治疗后,CCH小鼠脑中p300/CBP结合蛋白(CREB binding proteins,CBP)、组蛋白H3乙酰化(Acetylated Histone H3,Ac-H3)、组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)表达水平的变化,旨在探究BDNF表达调控的上游表观遗传修饰机制。7.体外采用培养神经元OGD模型,进一步确认GSRd对Ac-H3、HDAC2表达水平变化的影响,分析对BDNF表达的上游调控机制。8.采用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)方法,观察GSRd介导的BDNF表达增加是否通过促进Ac-H3与BDNF启动子IV区域的结合,或降低HDAC与BDNF启动子IV区域的结合实现;进一步,预先给予HDAC的抑制剂MS-275,观察是否可增强该效应,进而最终影响BDNF的表达。【研究结果】1.Morris水迷宫结果显示,与假手术组相比,CCH导致小鼠学习记忆障碍,表现为小鼠搜索平台时间(潜伏期)延长,目标象限游泳距离百分比降低,穿越平台次数减少(P?0.01);与模型组相比,GSRd治疗后,显著改善CCH导致的小鼠空间学习记忆障碍(P<0.05或P<0.01)。2.HE染色结果证实,与假手术组相比,CCH模型小鼠的PFC、CA1区域神经元的结构不清晰,出现细胞核固缩和大量细胞凋亡(P<0.01);与CCH模型组相比,给予GSRd治疗后神经元的形态结构与正常相似,细胞凋亡的比例下降(P<0.01);Western blot方法CCH小鼠脑内凋亡信号Caspase-3蛋白表达增加,给予GSRd治疗后降低Cleaved Caspase-3的表达(P<0.05或P<0.01)。3.q PCR、ELISA法检测发现,与假手术组相比,CCH小鼠海马中BDNF的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01);与模型组相比,GSRd治疗后BDNF的表达可恢复至近正常水平。4.MTT、LDH、FCM结果显示,培养的神经元经OGD损伤后,神经元出现凋亡,存活率显著下降(P<0.01),不同浓度GSRd处理则能提高细胞存活(P<0.05或P<0.01);同时,GSRd处理能够降低OGD条件下凋亡信号Caspase-3蛋白的高表达(P<0.05或P<0.01),提示GSRd的体外亦具有神经保护作用。5.与体内结果一致,采用体外培养神经元OGD模型,亦观察并确认不同浓度GSRd处理后,BDNF表达量增加(P<0.05或P<0.01),提示体外GSRd的神经保护作用可能通过增加BDNF的表达实现。6.Western blot方法分析BDNF表达调控的上游组蛋白修饰机制,结果显示,CCH损伤后,与假手术组相比,小鼠脑中p300/CBP、Ac-H3水平显著下降(P<0.01),而HDAC2表达水平升高(P<0.01);给予GSRd治疗后,则能逆转这些调控BDNF表达的上游蛋白的异常表达(P<0.01)。7.进一步采用培养神经元OGD模型,确认BDNF表达调控的上游组蛋白修饰机制,结果显示,与对照组相比,OGD/R组神经元Ac-H3表达水平显著下降(P<0.01),而HDAC2表达水平显著上升(P<0.01);GSRd处理后则可逆转这些上游蛋白的异常表达(P<0.01)。8.Ch IP法结果显示,OGD损伤促进HDAC2与BDNF启动子IV区域的结合,而降低Ac-H3与BDNF启动子IV区域的结合,导致BDNF的表达显著降低;给予GSRd处理后则可促进Ac-H3、降低HDAC与BDNF启动子IV区域的结合,使BDNF的表达恢复正常;进一步研究发现,预先给予HDAC的抑制剂MS-275,则可增强GSRd介导的该效应。该结果提示,OGD损伤条件下,BDNF的表达受到组蛋白修饰的调节。【研究结论】1.GSRd改善CCH导致的学习记忆障碍,并减轻CCH小鼠PFC和Hipp神经元的凋亡,该效应与CCH小鼠脑内BDNF表达增加相关;BDNF的表达受到P300/CBP、Ac-H3和HDAC2参与的组蛋白乙酰化的调节。故GSRd通过表观遗传学调控BDNF的表达,保护CCH时神经元免受损伤,从而改善空间记忆能力。2.体外研究证实,暴露于OGD/R导致神经元活力丧失,GSRd则对培养神经元起到神经保护作用。GSRd通过上调BDNF的表达,降低了OGD/R诱导的细胞活力丧失和LDH释放,这与形态分析和凋亡的Caspase-3指标一致。OGD/R处理足以增加HDAC2、减少Ac-H3,同时伴随BDNF表达的下降;GSRd处理可逆转上述种种变化,提示GSRd可能通过重建Ac-H3与HDAC2之间的平衡,参与BDNF转录调节,促进神经元存活。3.BDNF启动子IV区域受到组蛋白修饰机制的调控,作为HDAC的抑制剂——MS-275,与GSRd之间具有协同作用。上述结果提示,在CCH小鼠模型中,GSRd提供神经保护作用可能是通过组蛋白乙酰化修饰机制对BDNF进行调控而实现的,从而揭示了GSRd神经保护的潜在分子机制。尽管我们并不排除GSRd可能通过其他途径发挥神经保护作用,但本研究发现,GSRd的表观遗传调控机制有可能成为治疗CCH相关疾病的有效干预靶标。