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本论文共分四部分。
第一部分为绪论,介绍了酞菁及金属酞菁配合物的发展历史、结构、性质及应用领域。同时对本论文的测定对象一蛋白质的研究进展及本论文中运用到的光散射方法进行了综述。
第二部分介绍了四羧基金属酞菁配合物的合成路线及合成方法。采用液相法合成了四种四羧基金属酞菁配合物(四羧基酞菁铁、铜、镍、锌),并利用红外光谱和紫外·可见光谱对所合成的四种产物分别进行了表征,证实所合成的产物为四羧基金属酞菁配合物。
第三部分利用二级散射和共振散射法研究了四种四羧基金属酞菁配合物与蛋白质的作用情况,建立了四种测定蛋白质的新方法。
1.在pH3.8的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,蛋白质与四羧基铁(Ⅲ)酞菁(Fe(Ⅲ)Pc(COOH)4)结合,使二级散射信号Isos增强,且增强的二级散射信号与蛋白质浓度呈良好的线性关系。在最大的二级散射波长(λSOSmax)处分别对牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白(IgG)、a-糜蛋白酶(a-Chy),血清总蛋白(TP)进行测定,线性范围分别为0.0~1.80 mg·L-1、0.0~1.60 mg·L-1、0.03~1.20 mg·L-1、0.0~1.20 mg·L-1、0.0~0.90mg·L-1;相应检测限分别为49.30 ng·mL-1、38.35ng·mL-1、59.92ng·mL-1、97.32ng·mL-1、42.55ng·mL-1。将该方法应用于实际人血清样品中总蛋白的测定,结果与考马斯亮蓝G-250法基本一致。
2.在pH:3.0的Clark-Lubs酸性缓冲溶液中,蛋白质与四羧基铜(CuPc(COOH)4)作用,使体系的共振光散射增强,在λ=389nm处光散射强度最大,增强作用的强弱与蛋白质的含量成正比,据此建立了共振光散射测定蛋白质的新方法。此方法对牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白G(IgG)、鱼精蛋白(Protamin)、血清总蛋白(TP)的测定范围分别为0.05~1.60 mg·L-1、0.025~1.60 mg·L-1、0.0~1.45 mg·L-1、0.1~1.50 mg·L-1、0.0~1.60 mg·L-1,相应检出限分别为42.85ng·mL-1、70.05 ng·mL-1、63.66ng·mL-1、35.61ng·mL-1、40.25ng·mL-1。将此方法应用于实际人血清样品中总蛋白的测定,结果与考马斯亮蓝法基本一致。
3.在pH3.6的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,蛋白质与四羧基镍酞菁NiPc(COOH)4发生相互作用,使体系在λ=388nm处的共振散射增强,并且增强的散射强度与蛋白质的含量成比例,据此利用四羧基镍酞菁NiPc(COOH)4为光谱探针,以共振散射法测定人血清中的总蛋白质,同时优化了体系光散射检测的实验参数。在最佳的实验条件下,对牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、a-糜蛋白酶(a-Chy)、人血清总蛋白(TP)的线性范围分别为0.0~1.20mg·L-1、0.0~1.00 mg·L-1、0.0~1.00 mg·L-1、0.0~1.20 mg·L-1,相应检出限分别为35.90ng·mL-1、47.40ng·mL-1、71.98ng·mL-1、8.99ng·mL-1。将该方法应用于实际人血清样品中总蛋白的测定,结果与考马斯亮蓝法比较,令人满意。
4.在pH3.8的Clark-Lub’s(C-L)缓冲溶液中,蛋白质与四羧基锌酞菁ZnPc(COOH)4发生相互作用,使得体系在λex=λem=446nm处的共振散射增强,并且增强的散射强度与蛋白质的含量成比例。据此建立了四羧基锌酞菁ZnPc(COOH)4共振散射测定蛋白质的方法。方法对牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白G(IgG)、a-糜蛋白酶(a-Chy)、卵蛋白(EA)的线性范围分别为0.0~1.75mg·L-1、0.0~1.50mg·L-1、0.0~1.20mg·L-1、0.05~1.40mg·L-1、0.035~1.20mg·L-1,相应检出限分别为65.50ng·mL-1、59.96ng·mL-1、57.57ng·mL-1、63.50ng·mL-1、62.01ng·mL-1。对实际人血清样品和牛奶样品进行测定,结果与考马斯亮蓝法比较,令人满意。
第四部分采用光谱法研究了BSA-ZnPc(COOH)4之间的相互作用。实验证明,在BSA的等屯点之后(pH7.0),ZnPc(COOH)4做为荧光猝灭剂,对BSA的内源荧光起到规律性的猝灭作用,并且该猝灭过程为静态猝灭,分别求出了该体系的猝灭常数为2.21×105L·mol-1(293K)、1.73×105L·mol-1(308K),结合位数n为1,两者间在pH7.0时的相互作用力为疏水作用力。根据无辐射能量转移理论,确定了BSA-ZnPc(COOH)4之间的最小距离r为4.43nm。并用同步荧光光谱法探讨了四羧基锌酞菁对BSA构象的影响。