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目的:缺血性脑卒中是世界范围内致残率和致死率较高的疾病,有研究表明ANXA1(膜联蛋白1,annexin-1)在脑缺血/再灌注损伤中具有神经保护作用,但其作用机制尚待进一步研究。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞,在脑缺血/再灌注损伤中被活化而对神经元的损伤及修复中具有复杂的功能表现。本文以大鼠海马脑片及BV-2细胞(胶质瘤来源的小胶质细胞系)为研究对象,研究ANXA1对脑缺血/再灌注引起的小胶质细胞活化及迁移的影响,以探讨ANXA1的神经保护作用的细胞和分子机制。 方法:海马脑片培养并以氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)的方法构建组织缺血再灌注模型;以NeuN标记海马神经元,OX-42或 Iba1标记小胶质细胞,用免疫荧光多重标记技术检测ANXA1、甲酰肽受体(FPRs)在神经元及小胶质细胞上的表达;用全细胞膜片钳技术记录BV-2细胞的跨细胞膜电流;用Transwell迁移法及划痕实验法检测BV-2细胞的迁移能力;用免疫印迹技术(Western Blot)检测磷酸化α-catenin的表达水平。 结果: 1、OGD/R诱导海马神经元高表达ANXA1:免疫荧光显示ANXA1在海马脑片CA1、CA3和DG区均有表达。海马脑片OGD2h、复糖复氧24h后,ANXA1在CA1、CA3和DG区表达均有所增加,与对照组相比,CA1区的ANXA1表达增加具有显著性差异(p<0.01)。以NeuN标记神经元,Iba1标记小胶质细胞,免疫荧光多重染色结果显示, OGD/R处理后海马脑片中ANXA1与NeuN共标记细胞数量增多,与对照组相比,在CA1区的增加具有统计学差异(p<0.05);ANXA1与Iba1共标记细胞数量与对照组相比无统计学差异。结果提示,OGD/R诱导海马神经元高表达ANXA1。 2、OGD/R诱导海马小胶质细胞高表达ANXA1的受体FPRs:免疫荧光显示FPRs在海马脑片CA1、CA3和DG区均有表达;以NeuN标记神经元,OX-42标记小胶质细胞,免疫荧光多重染色结果显示,FPRs与NeuN共标记细胞数目稀少, FPRs与OX-42共标记数目占FPRs阳性细胞数总量的45.5%以上。海马脑片OGD2h、复灌24h后,与对照组相比,FPRs在海马脑片各区的表达量显著增加(p<0.01)。免疫荧光多重染色结果显示,OGD/R处理后FPRs与OX-42共标记细胞数量均显著高于对照组,具有统计学差异(p<0.01),而FPRs与NeuN共标记细胞数与对照组相比无显著性差异。结果提示, OGD/R诱导海马小胶质细胞高表达ANXA1受体FPRs。 3、ANXA1经由FPRs受体活化小胶质细胞:以Iba1标记活化小胶质细胞,免疫荧光显示,OGD/R处理后海马脑片CA1区Iba1免疫阳性细胞数显著增加,与对照组相比,其增加具有统计学差异(p<0.01)。在OGD阶段予以ANXA1模拟肽Ac2-26(1μM)处理能增加CA1区Iba1免疫阳性细胞数量;在此阶段予以FPRs受体拮抗剂Boc1(4μM)处理则显著减少Iba1免疫阳性细胞数量,与单纯OGD/R处理组相比,其减少具有统计学差异(p<0.01)。全细胞膜片钳记录的结果显示:BV-2细胞在+40 mV及以上跨膜电压引起的跨膜外向电流能被Ac2-26(3.3μM)处理明显增强,而在-80 mV~-60 mV跨膜电压范围内Ac2-26(3.3μM)处理能诱发跨膜内向电流;不同细胞个体的全细胞跨膜电流对Ac2-26(3.3μM)处理的反应有差异,全细胞跨膜电流明显受Ac2-26处理影响的细胞占60%(21/35)。结果提示,OGD/R诱导小胶质细胞活化,ANXA1对小胶质细胞的活化有促进作用。 4、ANXA1经由FPRs促进小胶质细胞迁移:用Transwell迁移实验和划痕实验检验细胞的迁移能力。Transwell迁移试验结果发现:Transwell下室加入1.32μM Ac2-26和13.2μM Ac2-26的处理均能显著提高上室细胞向下室的迁移率,与未加Ac2-26组相比,其迁移率增加具有统计学差异(p<0.05, p<0.01);ANXA1受体拮抗剂Boc1(10μM)能翻转Ac2-26的作用,显著降低细胞迁移率(p<0.05);10μM Boc1处理对未加Ac2-26组的细胞迁移率均没有显著影响。划痕试验发现, Ac2-26(13.2μM)处理能显著提高BV-2细胞向划痕区的迁移数量,与对照组相比具有显著差异性(p<0.01);Boc1(10μM)能翻转Ac2-26的作用,显著降低细胞迁移数(p<0.05);而Boc1(10μM)处理对未加Ac2-26组的细胞迁移数均无显著影响。这些结果提示:未做OGD/R处理时ANXA1能经由FPRs诱导小胶质细胞迁移。 对BV-2细胞进行OGD处理2h、复糖复氧24h,Transwell迁移试验和划痕试验均显示, OGD/R处理显著增加BV-2细胞迁移能力,与对照组相比有统计学差异(p<0.05)。与单纯OGD/R处理组相比,在OGD/R处理过程中加入Boc-1(10μM)能显著降低 BV-2细胞迁移能力(p<0.05),而在 OGD/R处理过程中加入 Ac2-26(1.32μM)能进一步增强BV-2细胞迁移能力(p<0.05),而加入Boc-1(10μM)能翻转Ac2-26的这种作用(p<0.05)。这些结果提示:OGD/R处理诱导小胶质细胞的迁移,而ANXA1在OGD/R处理过程中通过作用FPRs能增强小胶质细胞的迁移能力。 5、ANXA1通过CK2磷酸化α-catenin介导小胶质细胞迁移:Western Blot检测结果显示,Ac2-26(1.32μM)处理BV-2细胞24 h能显著提高α-catenin(ser-641)磷酸化水平,与对照组相比其增加具有显著性差异(p<0.05),CK2抑制剂TBB(40μM)能翻转Ac2-26的作用,显著降低α-catenin磷酸化水平(p<0.05),TBB对未加Ac2-26组的α-catenin磷酸化水平无显著影响。Transwell迁移试验显示,TBB(40μM)能翻转Ac2-26(1.32μM,加于下室)的作用,显著降低BV-2细胞迁移率(p<0.05);而 TBB对未加 Ac2-26组的BV-2细胞迁移率无显著影响。PKC抑制剂(GF109203X,2μM)、Raf抑制剂(TAK632,1μM)以及P38抑制剂(SB202190,0.1μM)处理均不能表现 TBB的上述两种翻转效应。结果提示 ANXA1通过激活CK2磷酸化α-catenin而促进小胶质细胞迁移。 结论:OGD/R处理增强海马脑片神经元的ANXA1表达以及海马脑片小胶质细胞的FPRs表达;OGD/R处理能促进海马脑片 CA1区内小胶质细胞的活化及BV-2细胞迁移,而 ANXA1作用于FPRs在其中发挥了重要作用。CK2磷酸化α-catenin参与到ANXA1介导的小胶质细胞活化和迁移的过程中。