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【背景】2型糖尿病(T2DM)是一种严重危害人类健康的慢性非传染病,主要特点为胰岛素抵抗、β细胞功能障碍及高血糖,可诱发眼、心、肾、血管和神经系统等多种组织器官的并发症。T2DM由遗传因素、环境因素以及行为因素共同作用导致,发病机制复杂。胰岛素抵抗是T2DM的主要病理生理机制及治疗难点。大量的文献及本实验室的研究表明,氧化应激在胰岛素抵抗发生发展过程中发挥重要作用。此外,线粒体损伤是胰岛素抵抗发生的关键机制。线粒体是细胞内生成ROS的主要部位,也是ROS诱发氧化损伤的主要靶点。然而,氧化应激与线粒体损伤在胰岛素抵抗发生发展过程中的相互作用及分子机制还不清楚。Nrf2是一种关键的抗氧化核心转录因子,通过调节一系列抗氧化酶的转录发挥作用。转录因子NRF-1通过调节mt TFA,在调控线粒体生物发生中发挥关键作用。文献报道,Nrf2对NRF-1的转录、线粒体生物发生及心肌保护有一定调控作用。然而,在胰岛素抵抗发生发展过程中,Nrf2和NRF-1是否存在相互作用还有待研究。本课题通过高脂饮食饲喂构建胰岛素抵抗动物模型,研究在胰岛素抵抗发生发展过程中,氧化应激、线粒体结构、功能及关键分子Nrf2和NRF-1、mt TFA等的变化特点;研究T2DM模式动物db/db鼠关键分子Nrf2、NRF-1、mt TFA变化特点;并在L02人正常肝细胞系中,通过转染p CDNA3-Myc3-Nrf2质粒,研究Nrf2对抗氧化酶及NRF-1、mt TFA等分子的调控机制。研究结果试图为发现新的胰岛素抵抗发病机制提供有价值的基础资料,为制定有效的干预措施提供重要的实验与理论依据。【目的】1.研究高脂饮食饲喂诱导胰岛素抵抗、肝脂肪变、氧化应激及线粒体损伤的动态变化特点。2.研究胰岛素抵抗发生发展过程中Nrf2、NRF-1、mt TFA的动态改变。3.研究Nrf2、NRF-1、mt TFA动态改变介导胰岛素抵抗的分子机制。【方法】1.高脂饮食饲喂构建胰岛素抵抗动物模型:采用含10%脂肪的高脂饮食饲喂,第8周和第12周测定葡萄糖/胰岛素耐量,第16至28周每4周测定葡萄糖/胰岛素耐量及其他分子生物学指标。2.胰岛素敏感性相关指标测定:动物禁食过夜,使用Roche血糖仪、血糖试纸测定空腹血糖;腹腔注射葡萄糖(1 g·kg-1)/胰岛素(0.75 IU·kg-1),测定葡萄糖/胰岛素耐量;取血清,使用ELISA试剂盒测定胰岛素含量;计算HOMA-IR;处死前30 min腹腔注射胰岛素(10 IU·kg-1)测定胰岛素信号。3.肝脏形态学指标检测:油红O染色观察肝脂肪变程度;天狼猩红-苦味酸染色观察肝纤维化。4.氧化应激相关指标测定:活性氧荧光探针DHE检测ROS;试剂盒检测MDA、GSSG/GSH及抗氧化酶活性。5.线粒体相关指标测定:透射电镜观察线粒体结构变化;液相氧电极检测耗氧量。6.细胞模型构建:在L02细胞系中转染p CDNA3-Myc3-Nrf2质粒,过表达Nrf2。7.关键分子测定:Western Blot检测Nrf2、NRF-1、mt TFA、P-Akt、SREBP1c及多种抗氧化酶表达水平。【结果】1.高脂IR动物葡萄糖耐量第12周起受损,血糖、胰岛素依次升高,第24周发生胰岛素耐量受损,胰岛素信号分子P-Akt第20周起降低,HOMA-IR始终升高;db/db鼠血糖、HOMA-IR升高,胰岛素降低。2.高脂IR动物肝脂肪变、肝纤维化逐渐加重,脂质合成关键转录因子SREBP1c表达第20-24周升高,第28周降至对照水平;db/db鼠发生严重肝脂肪变,SREBP1c显著升高。3.高脂IR动物肝脏ROS水平第16周升高,第24周后降低,MDA含量升高,抗氧化酶表达第16周升高,第28周降低;db/db鼠肝MDA、GSSG/GSH升高,CAT、SOD活性升高,GPx活性降低、表达升高,其余抗氧化酶表达无显著改变;L02细胞转染质粒80 h后抗氧化酶表达升高。4.高脂IR动物肝线粒体第16周起形态异常,逐渐加重;耗氧量第16周升高,第20周降低。5.高脂IR动物Nrf2(100 k D)第16-20周升高,第24-28周降低,Nrf2(61 k D)、NRF-1、mt TFA降低;db/db鼠Nrf2(100 k D)无显著变化,Nrf2(61 k D)、NRF-1、mt TFA降低;L02细胞转染质粒80 h后Nrf2(100 k D)升高,Nrf2(61 k D)、NRF-1、mt TFA无显著变化。【结论】1.肝脂肪变、氧化应激及线粒体损伤在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗发生发展中逐渐加重。2.Nrf2、NRF-1、mt TFA在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗发生发展中存在动态变化,并与肝脂肪变、氧化应激及线粒体损伤密切相关。3.与野生型小鼠相比,T2DM模式动物db/db鼠存在Nrf2、NRF-1、mt TFA改变。4.过量ROS通过抑制Nrf2(100 k D),削弱抗氧化防御系统功能,诱导氧化应激,促进胰岛素抵抗。5.过量ROS通过抑制Nrf2(61 k D),降低NRF-1、mt TFA表达,损伤线粒体功能,促进胰岛素抵抗。