一、研究背景： 慢性乙型肝炎感染严重影响全球人类的健康，全球超过20亿人口感染HBV，4亿人为慢性感染者，在亚太地区更为重要，75％感染者在亚洲，中国和印度占50％，我国每年有约30万人死于HBV感染导致的肝衰竭、肝硬化、肝癌。 慢性乙型肝炎的发展受病毒复制状态和机体免疫应答两个主要因素的影响。近年研究显示，宿主免疫应答中，细胞因子信号传导抑制因子(Suppressor of cytokine signaling) SOCS1、SOCS3通过抑制细胞因子信号转导调节机体对细胞因子的过度刺激，可能与肝病的发生发展有关。 二、研究目的： 本课题通过荧光定量PCR的方法检测HBV相关性肝病外周血中SOCS1、SOCS3mRNA的表达情况，对SOCS1与SOCS3与HBV相关性肝病的临床意义进行了初步分析。为进一步研究与治疗(如未来细胞因子的治疗等)提供依据。 三、材料和方法： 3.1研究对象 选取2008年9月—2009年3月中山大学附属第三医院感染科门诊及住院患者，诊断符合2006年中华医学会感染病学分会和中华医学会肝病学分会制定我国第一部《肝衰竭诊疗指南》及2000年西安《病毒性肝炎防治方案》，并排除了合并甲、丙、丁、戊型肝炎、肝细胞肝癌、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病；伴有冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉硬化症等心脑血管疾病；资料不完整者。根据入院时是否使用核苷类抗病毒药物，分为抗病毒组(至少2周以上)和综合治疗组。 3.2实验方法 (1)临床资料收集：年龄、性别、以患者住院3天内化验数据为计算指标，包括ALT、AST、总胆红素(TBIL)(umol/L)、肌酐(CREAT)(umol/L)、凝血酶原时间国际标准化比值(INR)，乙型肝炎病毒标记物：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、乙型肝炎C抗体(HBcAb)、乙肝病毒去氧核糖核酸的定量检测(HBV—DNA)、是否服用核苷类抗病毒药物及使用的种类、时间长短。 (2)设计SOCS1、SOCS3及内参β actin上、下游引物，收集肝素抗凝血3ml，用红细胞裂解液分离外周血单个核细胞，TRIZOL提取总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)为引物利用逆转录酶反转录成cDNA，采用半定量RT—PCR法检测外周血单个核细胞中SOCS1、SOCS3mRNA表达。 (3)数据分析采用2-△△Ct法，Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数．计算公式：F=2-[待测组目的基因平均Ct值—待测组管家基因平均C±值]—[对照组目的基因平均Ct值—对照组管家基因平均Ct值] 3.3统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计，两组均数比较采用t检验，等级相关资料使用Spearman非参数相关分析，检验水准是0.05。 四、结果： 4.1一般资料 本研究90例乙肝患者，正常对照组10例，男性7例，女性3例，最小24岁，最大40岁，平均年龄28.2岁。 表1 HBV相关性肝病基础资料 4.2乙肝相关性肝病外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达 正常组、肝衰竭组、肝硬化组、慢性肝炎组外周血单个核细胞中均可见SOCS1、SOCS3mRNA表达，对肝衰竭组、肝硬化组、慢性肝炎组和正常组进行两两比较，结果显示各组SOCS1mRNA在外周血中表达水平不同，但差异无统计学意义(P值均>0.05)。 SOCS3mRNA在肝衰竭组外周血单个核细胞中的表达明显高于正常组，是正常组的4.39倍，P值=0.012(<0.05)，差异有统计学意义；肝硬化组SOCS3mRNA表达高于正常组，P值=0.001(<0.01)，是正常组的3.9倍，慢性肝炎组SOCS3表达与正成组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 4.3外周血中SOCS1、SOCS3 mRNA表达与抗病毒治疗、HBeAg、乙肝病毒复制状态的关系 4.3.1 SOCS1、SOCS3 mRNA表达与抗病毒治疗的关系 根据是否有2周以上核苷类抗病毒药物治疗史，将肝衰竭组、肝硬化组患者分为抗病毒组及综合治疗组，采用T检验法，分析各组SOCS1、SOCS3表达与抗病毒治疗的关系。 结果显示：肝衰竭、肝硬化抗病毒组和综合治疗组外周血中SOCS1、SOCS3mRNA表达差异无统计学意义(P值>0.05)。 4.3.2 SOCS1、SOCS3 mRNA表达与HBeAg关系 肝衰竭、慢性肝炎HBeAg阳性组、阴性组SOCS1、SOCS3在外周血单个核细胞中的表达无差异(P>0.05) 肝硬化HBeAg阳性组SOCS1mRNA表达高于阴性组，P值=0.021(<0.05)，差异有统计学意义，SOCS3表达差异无统计学意义。 4.3.3 SOCS1、SOCS3 mRNA表达与HBV—DNA定量关系 慢性肝炎外周血中SOCS1因子表达水平与血HBV DNA定量表达水平之间存在负相关，差异有统计学意义(rs=-0.555，p=0.017<0.05)。SOCS3与血HBVDNA定量表达水平之间无相关性。 肝衰竭、肝硬化外周血中SOCS1、SOCS3表达水平与血清HBV DNA定量之间无相关性(p>0.05)。 4.4外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达水平与病情轻重的关系 采用Spearman非参数相关分析，对各组外周血单个核细胞中SOCS1、SOCS3mRNA表达水平与肝功生化指标(PT、PTA、ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL)及MELD评分之间的相关关系进行分析。 4.4.1乙肝慢加急肝衰竭患者 结果显示，SOCS1、SOCS3mRNA表达水平与肝功生化指标、MELD评分无相关性(P>0.05)。 4.4.2乙肝肝硬化患者 肝硬化外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达水平显著相关，(rs=0.524，P=0.003，P<0.01)。SOCS1表达水平与乙肝肝硬化临床生化指标PT负相关，(rs=—0.515，P=0.004，P<0.01)，与PTA正相关(rs=0.509，P=0.004，P<0.01)。SOCS1表达水平与其它肝功生化指标(ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL)及MELD评分之间无相关性。SOCS3mRNA表达与肝功生化指标(PT、PTA、ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL)及MELD评分之间无显著性相关。 4.4.3慢性乙型肝炎患者 SOCS1表达水平与慢性肝炎临床生化指标AST负相关，(rs=—0.533，P值为0.019，P<0.05)，但与ALT、ALB、TBIL、DBIL、PT、PTA、MELD评分无显著性相关(P>0.05)。SOCS3表达水平与慢性乙型肝炎临床生化指标ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL、PT、PTA、MELD评分均无明显相关，(P>0.05)。 4.5外周血中SOCS1和SOCS3表达水平之间的关系 肝衰竭外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达水平显著正相关，(rs=0.737，P值为0.000，P<0.01)。 肝硬化外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达水平显著正相关，(rs=0.57，P值为0.011，P<0.05)。 慢性肝炎外周血单个核细胞中SOCS1和SOCS3表达水平无相关(P>0.05)。 五、结论： 1.乙肝肝衰竭、肝硬化患者外周血单个核细胞中SOCS3mRNA表达增高，肝硬化组SOCS1mRNA表达与PTA正相关，慢性肝炎组SOCS1表达与AST负相关，提示两者可能均与慢性乙型肝炎进展的慢性化、肝纤维化有关，但可能存在不同的作用环节。 2.慢性乙型肝炎组SOCS1表达水平与与血HBV DNA定量表达水平之间存在负相关，但乙肝肝硬化HBeAg阳性组SOCS1表达高于阴性组，提示SOCS1表达可能既受病毒影响，又受肝纤维化进展影响，在慢性肝炎时期SOCS1表达与病毒水平有关，在肝硬化中可能与纤维化关系更大。