论文部分内容阅读
肝纤维化是由一种或者多种损伤因素诱导的肝脏细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积的病理过程,是各种慢性肝病发展为肝硬化甚至肝癌的关键阶段。其中,活化的肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）是ECM的主要来源,在肝纤维化病理进程中发挥关键作用。抑制或清除活化型HSC可以逆转肝纤维化。然而,目前尚无理想的临床药物能够用于肝纤维化的治疗。因此,探索HSC活化机制并寻找有效清除活化型HSC的治疗药物,是肝纤维化治疗领域急需解决的问题。铁死亡是一种依赖于铁的程序性细胞死亡方式,是被认为与疾病进展高度相关的新型细胞死亡方式。不同于其他已知的细胞凋亡、坏死和自噬等细胞死亡方式,铁死亡表现为谷胱甘肽（Glutathione,GSH）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）失活、细胞内脂质活性氧（Reactive oxygen species,ROS）过度积累和脂质过氧化。铁死亡与多种人类疾病的关系已被证实,课题组前期研究表明,诱导HSC铁死亡可能是肝纤维化的潜在治疗方法,但HSC铁死亡的调控机制尚不明确。本研究发现N6腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A）修饰在HSC铁死亡中发挥重要作用,并且m6A修饰是真核mRNA中最丰富的转录后调控机制,本论文创新性的提出科学假说:m6A修饰调控HSC铁死亡改善肝纤维化病理损伤。探索m6A修饰介导的HSC铁死亡的转录后调控机制可能为肝纤维化治疗提供新的治疗靶点。本论文首先明确铁死亡诱导剂能够抑制HSC活力并上调铁死亡相关指标,但是铁死亡抑制剂而非凋亡和坏死抑制剂能够阻断HSC铁死亡。有趣地,斑点杂交和m6A修饰定量试剂盒检测结果均显示铁死亡诱导剂能够明显上调HSC中的m6A修饰水平。Western blot和real-time PCR结果显示甲基化酶METTL4表达上调和去甲基化酶FTO表达下调可能是铁死亡诱导剂上调HSC中m6A修饰水平的主要原因。此外,干扰METTL4或过表达FTO能够降低HSC中的m6A修饰水平进而抑制HSC中经典的铁死亡指标。综合上述结果,上调的m6A修饰可能调控了 HSC铁死亡。为了进一步确定m6A修饰调控HSC铁死亡的分子机制,过表达去甲基化酶FTO再给予铁死亡诱导剂处理,随后进行RNA测序以确定潜在调控的靶基因,结果显示铁死亡相关基因如SLC7A11、SLC3A2、GPX4等被筛选出来,验证了筛选方法的合理。有趣地,KEGG通路分析表明自噬通路的激活可能是m6A修饰诱导HSC铁死亡的潜在调控机制。MeRIP qPCR显示自噬关键基因BECN1的m6A修饰水平明显升高。干扰METTL4或过表达FTO可以降低HSC中的m6A修饰水平进而抑制BECN1蛋白表达而非其他自噬相关蛋白,并且抑制了自噬指标LC3-Ⅱ的转化以及自噬流的形成。而过表达BECN1能够削弱干扰METTL4或过表达FTO抑制HSC铁死亡的作用。综上所述,BECN1介导的自噬通路的激活是m6A修饰调控HSC铁死亡的潜在调控机制。m6A修饰的RNA最终被m6A识别蛋白结合进而调控RNA的生物学功能,本论文通过进一步的探究发现,YTHDF1是调控HSC铁死亡的关键m6A识别蛋白。干扰YTHDF1能够削弱BECN1诱导的HSC铁死亡,Western blot也显示干扰YTHDF1明显降低铁死亡诱导剂处理的HSC中BECN1的表达。值得注意地,YTHDF1通过识别BECN1编码区的m6A结合位点促进了BECN1 mRNA的稳定进而激活自噬。m6A结合位点的突变削弱了 YTHDF1介导的BECN1 mRNA稳定性,进而抑制了 HSC铁死亡。接下来,构建CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型并用铁死亡诱导剂erastin治疗,组织病理学结果显示erastin明显改善了小鼠肝纤维化病理损伤,而特异性抑制HSC的m6A修饰能够减少HSC铁死亡,进而阻断erastin对小鼠肝纤维化的改善作用。综合以上结果,m6A识别蛋白YTHDF1促进了 m6A修饰的BECN1 mRNA的稳定,进而激活自噬诱导HSC铁死亡发挥缓解肝纤维化的作用。青蒿素是从中药黄花蒿中提取的具有抗疟活性的倍半萜内酯类化合物。其中,双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）是其活性较强的衍生物。结果表明,DHA能够通过诱导HSC铁死亡来抑制HSC活化,而铁死亡抑制剂明显削弱了 DHA对HSC活化的抑制作用。有趣地,DHA处理明显增加HSC的自噬水平,自噬抑制剂3-MA能够显著削弱DHA诱导的HSC铁死亡。进一步的机制研究发现,DHA能够抑制HSC中m6A修饰相关的去甲基化酶FTO的表达,致使HSC中m6A修饰水平升高。此外,BECN1 mRNA的m6A修饰水平在DHA诱导的HSC铁死亡中显著上调。YTHDF1作为BECN1 mRNA的识别蛋白,促进了BECN1 mRNA的稳定,并且进一步的研究表明YTH结构域对YTHDF1稳定BECN1 mRNA至关重要。体内研究中,DHA通过诱导HSC铁死亡缓解了小鼠肝纤维化,而特异性抑制HSC中m6A修饰和自噬能够削弱DHA诱导HSC铁死亡的作用。综上,本论文阐述了 m6A修饰调控HSC铁死亡改善肝纤维化的作用机制及DHA干预效应,研究结果表明m6A修饰可能是HSC铁死亡的关键转录后调控机制;发现DHA能够调控m6A修饰抑制HSC活化,研究结果为DHA治疗肝纤维化提供理论依据。