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HBV与肝癌的关系甚为密切，近年来HBV已明确为肝肿瘤病毒，是肝癌的重要风险因子之一，但其复杂的致癌机制仍有待进一步研究。HBV多聚酶YMDD模序是HBV基因复制和转录的功能保守区，对HBV病毒颗粒的装配和致病过程具有重要作用，PORF保守区位点的突变直接影响到HBV病毒颗粒复制及致癌基因X等的表达，在HBV相关的肝癌中可能起着十分重要的作用，探讨肝癌中HBV多聚酶YMDD模序变异对肝癌发生的分子病毒机制的阐明很有意义。
从HBVYMDD模序突变的角度、肿瘤中midkine、survivin、caspase-3mRNA和蛋白表达、肿瘤细胞增殖、凋亡多个角度进行分析，探讨与肝癌发生相关的分子病毒机制，研究midkine、survivin和caspase-3在肝癌中的表达特点及其与肝癌临床病理或生物学特性之间的关系，探讨HCC发生的分子机制，为肝癌的防治提供更多、更好的临床和实验资料。
1.1用改进的反向斑点杂交方法对乙型肝炎病毒基因组中YMDD模序突变进行快速、准确地分型
目的：开发一个新的、能快速和准确的检测HBVYMDD模序突变的方法。方法：利用反向斑点杂交(RDB)原理，结合具有负压装置的凯普杂DNA交仪，建立流过式反向斑点杂交方法，用以检测HBVYMDD模序突变。双盲实验中，100个以前通过DNA测序的样品用于评价本方法的敏感性和特异性。常规RFLP方法也用于检测该方法的正确性。
结果：双盲实验结果表明，这种改进的RDB方法准确性和特异性达100％，而RFLP准确性只有83％。临床标本检测中，49例被高度怀疑为拉米夫定耐药的病人标本已成功地用本方法检测。
结论：我们建立的这种流过式反向斑点杂交方法是一种简单、快速、廉价、半自动化、准确、敏感和防污染的检测HBV基因组中拉米夫定耐药突变的方法。
1.2HBVYMDD模序突变及其与肝癌发生的关系
目的：为探讨HBV多聚酶区/逆转录酶区的YMDD模序突变与肝病临床结果之间的关系，分析肝癌血清HBVYMDD模序突变规律。阐明HBVYMDD模序突变及其与肝癌的关系。
方法：血清HBVDNA提取后用已建立的“流过式”反向斑点杂交方法分析了45例LC、47例CHB和60例肝癌病人血清HBVYMDD模序突变情况。统计分析CHB、LC和HCC中HBVYMDD模序突变与拉米夫定用药时间、ALT、AST等的关系。
结果：经统计未用药的HCC组、短期用药的LC组和长时间用药的CHB组中HBVYMDD模序突变率分别为：1.67％(1/60)、4.44％(2/45)和63.82％(30/47)。HCC组同LC组相比，差异不显著(p=0.4)；而CHB组和HCC组或LC组相比，都存在显著差异。通过Spearman相关性分析表明，HBVYMDD模序突变与用药时间长短显著相关(p＜0.01)，与HCC的发病无关。HBVYMDD模序突变与ALT相关性不显著(p=0.126)，但与AST显著相关(p＜0.05)。
结论：ALT是拉米夫定用药过程中与HBVYMDD突变有关的较为敏感的肝功能生化诊断和病情监测指标。AST是肝细胞损伤严重程度的指标，很好地反映了HBV引起的肝病临床结果。HBVYMDD模序突变与肝脏病理过程(慢乙肝、肝硬化、肝癌)无关，只与拉米夫定用药时间长短密切相关，结果表明HBVYMDD模序突变并不是肝癌致病的分子机制。
2.1实时荧光定量RT-PCR检测midkine、survivin、caspase-3和β-actin基因表达方法的建立目的：构建包含midkine、survivin、caspase-3及β-actin基因片段的阳性质粒；建立midkine、survivin、caspase-3及β-actin基因表达的荧光定量检测方法方法：通过引物、探针设计，阳性质粒模板的构建，实时荧光定量RT-PCR方法的优化，组织RNA提取，最后用建立好的实时荧光定量RT-PCR方法检测组织中的基因表达。
结果：成功构建了阳性模板，为荧光定量RT-PCR方法的评价及准确定量提供了有力保障；建立了一套midkine、survivin、caspase-3及β-actin基因表达的有效检测方法。
结论：本研究所建立的midkine、survivin、caspase-3及β-actin基因表达的实时荧光定量RT-PCR方法具有稳定、灵敏、定量准确、能有效消除管间差异等优点，可有效地应用于肝癌组织中基因表达水平的研究，为肝癌的早期诊断、预后评价及分子发生机制的研究提供了一个新的、有力的手段。
2.2MIDKINE和SURVIVIN在肝癌中的表达特点及其与肝癌生物学特性的关系
方法：实时荧光定量RT-PCR、免疫组织化学技术、细胞原位杂交技术。结果：实时荧光定量RT-PCR检测结果表明midkine、survivin和caspase-3几乎在所有组织中都有不同程度的表达，midkine和survivin在肝癌组织中过表达明显。实时荧光定量RT-PCR方法检测，midkine和survivin在正常组织中的表达水平极低，分别为0.11±0.12和0.11±0.08，在肝癌组织中的表达水最高平分别为1.01和1.26，正常肝组织、癌旁组织、肝硬化组织及肝癌组织中midkine和survivin的表达依次升高；caspase-3则相反，在正常肝组织中表达最高(0.67±0.09)，癌旁组织则表达下降为0.39±0.43，同正常组织相比，caspase-3在癌旁组织、肝癌组织及肝硬化组织中都有明显的caspase-3表达下调。Midkine和survivin蛋白在正常肝组织、癌旁组织、肝硬化组织和肝癌组织中阳性表达率依次上升，肝癌中表达最高，两者分别为：71.7％和78.1％。Caspase-3蛋白在正常肝组织(100％)、癌旁组织(61.0％)、肝硬化组织(75％)和肝癌组织(48.8％)中表达依次下降。各组织中midkine和survivin在转录和翻译水平都具有协同表达的特性。
肝硬化组织、癌组织及癌旁组织的AI分别是正常肝组织(AI为1.06)的3.16倍、3.24倍和3.73倍，Spearman等级相关分析表明，AI增加显著(p＜0.05)。正常肝组织、肝硬化组织、癌旁组织和肝癌组织的细胞PI依次为10.98±6.59、16.86±2.79、12.51±2.73和55.25±9.47；同其他组织相比，HCC中PI有极显著增加(p＜0.01)。Spearman等级相关分析表明，midkine、survivin的相对表达与PI有明显的正相关。Midkine、survivin与AI亦存在显著的正相关关系。
结论：免疫组化结果与荧光定量RT-PCR结果一致，只是灵敏度不如荧光定量方法，进一步证明荧光定量RT-PCR是一种更灵敏的检测基因表达的方法，是强有力的检测组织中基因表达的技术，它具有灵敏度高、定量准确和可重复的优点。荧光定量RT-PCR检测到正常组织中midkine和survivin有极少量表达，可能这是正常细胞更新、细胞DNA复制及有丝分裂必需的，是一种正常细胞周期进展的不可或缺的因子。而病理条件下，midkine和survivin表达迅速上升，细胞周期推动加强，细胞有丝分裂加快，细胞迅速增殖，组织细胞增生明显，这可能是肝癌发生的一个非常重要的机制。
Midkine和survivin具有协同表达特性，都与肝癌发生密切相关。两者都可以通过抑制caspase-3抑制凋亡、促进细胞有丝分裂和细胞增殖的作用。当survivin或midkine过表达时，细胞凋亡检查点受限制，凋亡减少，同时细胞有丝分裂加强，造成组织细胞增殖增加，引起肿瘤细胞的快速生长。所以survivin和midkine都是细胞有丝分裂和细胞增殖的重要因子。
具有不同病变程度的肝硬化组织和肝癌组织中AI明显比正常肝组织增高，但caspase-3却是下降，说明病变肝组织除了启动依赖caspase的凋亡途径，还启动了不依赖caspase的凋亡途径，导致细胞凋亡增加。从转录和翻译的分子水平探讨了HCC的发病机理，结果表明HCC的发病并不是因为survivin和midkine抑制了caspase-3的表达和活性，达到抑制细胞凋亡，而使细胞增殖，而主要是通过促进细胞增殖使肝组织细胞绝对数量增加。